CD32在人肝癌细胞株上的表达.doc

1CD32 在人肝癌细胞株上的表达作者：李和军 刘宁 李频 郑祥雄【摘要】 目的 检测 CD32 在人肝癌细胞株 SMMC 7721、BEL 7404 、HepG2 上的表达，探索其在肿瘤免疫治疗中的应用价值方法 分别应用 RT PCR 方法、流式细胞术检测 3 种肝癌细胞株上 CD32 的表达情况，以 u937 为阳性对照结果 u937 高表达 CD32，而肝癌细胞株 SMMC 7721、BEL 7404 、HepG2 未检测到CD32 的表达结论 肝癌细胞株 SMMC 7721、BEL 7404 、HepG2 不表达CD32，应用基因工程方法调节肿瘤细胞上不同亚型 CD32 的表达,或许可以激发机体抗肿瘤免疫，成为肿瘤免疫治疗的新途径 【关键词】 CD32;肝癌细胞;肿瘤免疫治疗CD32 是免疫球蛋白 IgG 受体 FcγR 中的一种，已有研究表明 CD32 与肿瘤的发生、发展密切相关，因此调节 CD32 等 FcγR 的表达，或许可以成为治疗肿瘤的一条新途径目前对于肿瘤细胞上 CD32 表达情况知之甚少，本文利用 RT PCR 方法及流式细胞术检测肿瘤细胞 CD32 的表达，为下一步探讨 CD32 在肿瘤发生发展中的作用及研究治疗肿瘤的新途径奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料 胰酶、RPMI1640 和 Trizol 试剂为 Gibco BRL 公司产品胎牛血清为杭州四季青生物技术公司产品逆转录酶、Taq DNA 聚合酶为 Promega 公司产品FITC 标记的鼠抗人 CD32 单克隆抗体(mAb)购自深圳晶美公司人肝癌细胞株 SMMC 7721、BEL 7404、HepG2 由本院肝胆研究所馈赠，髓系白血病细胞2株 u937 由本院血液病研究所惠赠1.2 RNA 的提取及 RT PCR 检测 CD32 片段 引物序列由上海生物工程有限公司合成上游：5′ AAAGGCTGTGCTGAAACTCG 3′;下游：5′ TGCTTGTGGGATGGAGAAGT 3′，PCR 产物为 400 bp各细胞株在含 200 ml/L 胎牛血清的 RPMI1640 环境中培养 36 h收获细胞,用 Trizol 试剂提取总RNA，以 RT PCR 扩增目的基因片段，PCR 条件为：94℃变性 60 s，55℃退火 60 s，74℃延伸 60 s，共循环 30 次PCR 产物在 15 g/L 琼脂糖凝胶中电泳后观察结果1.3 流式细胞术检测细胞膜表面 CD32 的表达 用 PBA 稀释的 PE 荧光标记小鼠抗人 CD32 抗体 200 μl 重悬细胞，4℃静置孵育 30 min，离心洗涤后用冷 PBS 200 μl 重悬细胞，上机检测;以 PE 标记的小鼠抗人 IgG 为阴性对照，以 u937 为阳性对照。

2 结 果2.1 RT PCR 检测 CD32 片段 应用 RT PCR 法扩增 CD32 膜外段基因，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，u937 细胞株可扩增出 1 条特异性条带，与预测的结果一致;而肝癌细胞株 SMMC 7721、BEL 7404、HepG2 均未检测到预期的特异性条带见图 11.GeneRulerTM 100 bp DNA Marker;2.阴性对照组;3.u937 组;4.SMMC 7721组;5.BEL 7404 组;6.HepG2 组图 1 RT PCR 法检测人肝癌细胞株 CD32 的表达32.2 流式细胞术检测肝癌细胞株 CD32 的表达 流式细胞术检测显示，u937 高表达 CD32，表达率为 99.6%;而肝癌细胞株 SMMC 7721(表达率 2.94%)、BEL 7404(表达率 0.98%)、HepG2(表达率 0.84%)细胞膜上未检测到 CD32 的表达 3 讨 论免疫球蛋白 IgG 受体 FcγR 包括 CD16、CD32、CD64，属 Ig 超家族CD32 即FcγR Ⅱ，是人 IgG Fc 低亲和力受体，主要表达于单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、朗罕细胞、B 细胞、血小板和胎盘内皮细胞等表面，在介导炎症介质的释放、ADCC、抗原提呈、吞噬或吞饮中发挥作用〔1〕。

已证实 CD32分为 CD32A、CD32B、CD32C 3 个亚型，各型之间的主要差别在于胞内区结构不同其中 CD32A 为活化型受体，胞内区域包含酪氨酸受体活化基序(ITAM)，与免疫复合物结合后导致酪氨酸磷酸化，激活细胞;而 CD32B 为抑制性受体，胞内区域包含酪氨酸受体抑制基序(ITIM)〔2〕，与免疫复合物结合后引发基于 ITIM 信号的级联反应，抑制细胞的活化，甚至诱发细胞的凋亡，两者可共存于同一细胞表面，维持正常的生理平衡，与肿瘤、自身免疫性疾病的发生、发展及治疗相关既往研究表明，随着 B 细胞发育成熟，CD32 表达逐渐增加，成熟 B 细胞主要表达CD32B，其与 BCR(B 细胞抗原受体)交联后，能够抑制 BCR 诱发的细胞活化，起负性调节作用而急性 B 淋巴细胞白血病的幼稚 B 细胞则主要表达 CD32A，用抗 CD32 抗体与 CD32A 交联，可以抑制幼稚 B 淋巴细胞生长〔3〕近期研究发现，在肿瘤抗原刺激下，缺乏 CD16、CD64 或缺乏 CD32 的 BALB/c 小鼠都可产生针对肿瘤的特异性抗体，但在随后接受肿瘤细胞的刺激时，缺乏 CD16、CD64 的小鼠仍无法抑制肿瘤的发生，而缺乏 CD32 的 BALB/c 小鼠则可以抑制肿瘤的生长，表明 IgG Fc 受体对于肿瘤的发生、发展有着重要作用〔4〕。

也有研究表明，活化型4受体的存在是利妥昔单抗(rituximab)和曲妥珠单抗(trastuzumab)在体内发挥抗肿瘤作用所必需的，CD32 与人鼠嵌合型抗 CD20 单克隆抗体治疗 CD20 阳性的淋巴瘤的机制有关〔5〕因此调节 CD32 等 FcγR 的表达，或许可以成为治疗恶性肿瘤的一条新途径在本研究中，RT PCR 及流式细胞技术均检测到 u937 高表达 CD32，与既往的研究一致，表明两种方法可正确检测细胞 CD32 的表达而在人肝癌细胞株SMMC 7721、BEL 7404、HepG2 上均未检测到 CD32 的表达，表明这 3 种肝癌细胞株均未表达 CD32既往的研究已经表明，肿瘤在体内的免疫逃避是肿瘤无限制生长的重要机制，如何激发机体的抗肿瘤免疫是免疫治疗肿瘤的研究热点CD32 作为一种 Ig Fc 受体，在肿瘤的发生发展中具有重要作用，因此利用基因工程技术调节肿瘤细胞不同亚型 CD32 的表达，或许可以有效激发机体的抗肿瘤免疫，值得进一步研究参考文献】1 龚非力.基础免疫学〔M〕.武汉：湖北科学技术出版社，1998：406 7.2 van den Herik Oudijk IE，Capel PJ，van der Bruggen T,et al. Identification of signaling motifs within human Fc gamma RⅡa and Fc gamma RⅡb isoforms〔J〕.Blood，1995;85(8):2202 11.3 Suzuki T，Coustan Smith E，Mihara K,et al.Signals mediated by Fc_RⅡA suppress the growth of B lineage acute lymphoblastic leukemia cells〔J〕. Leukemia，2002;16(7):1276 84.4 Lowe DB，Shearer MH，Jumper CA,et al.Fc gamma receptors play a dominant role in protective tumor immunity against a virus encoded tumor specific antigen in a murine model of experimental pulmonary metastases〔J〕.J Virol，2007;81(3):1313 8.5 Flieger D，Renoth S，Beier I,et al.Mechanism of cytotoxicity induced by chimeric mouse human monoclonal antibody IDEC C2B8 in CD20 expressing 5lymphoma cell lines〔J〕.Cell Immunol，2000;204(1):55 63.。