实验三血清γ球蛋白的分离、纯化及鉴定七年制.ppt

血清血清γγ球蛋白的球蛋白的分离纯化与鉴定分离纯化与鉴定刘晓如【【实验目的实验目的】】1 1．．学学习习盐盐析析法法、、凝凝胶胶层层析析和和离离子子交交换换层层析析分分离离纯纯 化蛋白质的基本原理及应用化蛋白质的基本原理及应用2 2．掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用．掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用3 3．了解蛋白质分离纯化的总体思路．了解蛋白质分离纯化的总体思路2 【【实验方法实验方法】】 一、盐析法粗分一、盐析法粗分γ-γ-球蛋白球蛋白 二、凝胶过滤方法脱盐二、凝胶过滤方法脱盐 三、离子交换层析方法纯化三、离子交换层析方法纯化γ-γ-球蛋白球蛋白 四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-γ-球蛋白的纯度球蛋白的纯度 3【【基本原理基本原理】】 蛋白质的分离、纯化及鉴定蛋白质的分离、纯化及鉴定是研究蛋白质化学性是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段之一质及生物学功能的重要手段之一 不同蛋白质的不同蛋白质的分子量、溶解度分子量、溶解度及在一定条件下，及在一定条件下，带带电的情况电的情况等都有所不同。

利用这些性质的差别，可分等都有所不同利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质离纯化各种蛋白质4分离蛋白质的方法分离蛋白质的方法分离方法分离方法沉淀法沉淀法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法层析法层析法 电学法电学法电泳法电泳法等电聚焦等电聚焦超速离心法超速离心法离子交换层析离子交换层析吸附层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）凝胶过滤（分子筛）亲和层析亲和层析在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的5【【基本原理基本原理】】 本实验采用本实验采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过滤、离子交换层析滤、离子交换层析方法，分离纯化血清方法，分离纯化血清γ-γ-球蛋白最后用球蛋白最后用醋酸纤维素薄膜电泳法醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定鉴定γ-γ-球蛋白的纯度球蛋白的纯度 6实验思路实验思路实验思路实验思路分段盐析去除杂蛋白分段盐析去除杂蛋白凝胶层析脱盐凝胶层析脱盐交联葡聚糖吸水浓缩交联葡聚糖吸水浓缩醋酸纤维素薄膜电泳鉴定醋酸纤维素薄膜电泳鉴定先先粗粗后后细细离子交换层析纯化离子交换层析纯化一、盐析法粗分离血清一、盐析法粗分离血清γ-γ-球蛋白球蛋白 盐析法是根据不同蛋白质在不同浓度的中盐析法是根据不同蛋白质在不同浓度的中性盐溶液中性盐溶液中溶解度溶解度不同，分别析出，达到彼此不同，分别析出，达到彼此分离的方法。

分离的方法 本本实实验验在在半半饱饱和和硫硫酸酸铵铵溶溶液液中中，，清清蛋蛋白白溶溶解解，，球球蛋蛋白白将将沉沉淀淀析析出出，，经经离离心心所所得得的的沉沉淀淀即即为球蛋白的粗提液为球蛋白的粗提液8定定义义：：加加入入大大量量中中性性盐盐以以破破坏坏蛋蛋白白质质的的稳稳定定因素并使从溶液中沉淀析出的现象因素并使从溶液中沉淀析出的现象 原理原理: : 破坏蛋白质两个稳定因素：破坏蛋白质两个稳定因素： 水化膜和电荷层水化膜和电荷层中性盐中性盐：：(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4、、NaNa2 2SOSO4 4、、NaClNaCl等优点：优点：蛋白质不变性，常用蛋白质不变性，常用盐析法盐析法9盐析步骤盐析步骤取离心管一支加入血清取离心管一支加入血清 2ml加入加入2ml 0.9%氯化钠摇匀氯化钠摇匀边搅拌混匀边缓慢滴加饱和边搅拌混匀边缓慢滴加饱和(NH4)2SO4 4ml上清液（主要含清蛋白）上清液（主要含清蛋白）倾去倾去静置静置10min，再离心（，再离心（5000转转/分）分）10min沉淀用沉淀用1ml 0.9%氯化钠搅拌溶解氯化钠搅拌溶解逐滴加饱和逐滴加饱和(NH4)2SO4 2ml, ,摇匀摇匀静置静置10min，再离心，再离心（（5000转转/分）分）10min倾弃上清液（主要含倾弃上清液（主要含αα、、ββ球蛋白）球蛋白）沉淀即为初步纯沉淀即为初步纯化的化的γγ－球蛋白－球蛋白加入加入0.0175mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液（（pH=6.3)1ml溶解溶解γγ－球蛋白－球蛋白粗提液粗提液10二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐 欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中大量欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中大量盐，通常有两种方法：盐，通常有两种方法： 凝胶层析法、透析凝胶层析法、透析本试验采用本试验采用葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶————SephadexSephadex G 25 G 25层析层析方法方法除去球蛋白粗提液中的盐除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵硫酸铵，以便下一步用离子，以便下一步用离子交换层析方法进一步提纯球蛋白。

交换层析方法进一步提纯球蛋白 11凝胶层析凝胶层析原理：原理：P31 凝胶层析法是按混合物各组分凝胶层析法是按混合物各组分分子量分子量大小大小不同随不同随流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术 凝胶凝胶凝胶凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一当吸收一当吸收一当吸收一定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质相互作用的惰性物质，相互作用的惰性物质，相互作用的惰性物质，相互作用的惰性物质，凝胶凝胶层析以其为固定相层析时，层析以其为固定相层析时，层析以其为固定相层析时，层析以其为固定相层析时，直径大于凝胶网孔的直径大于凝胶网孔的大分子物质大分子物质大分子物质大分子物质不能进入凝胶内部，只不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、流速快，首先流出层析柱；而流速快，首先流出层析柱；而小分子物质小分子物质小分子物质小分子物质直径小于凝胶直径小于凝胶网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定时间时间层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目的的的的。

12凝胶层析法脱盐凝胶层析法脱盐13凝胶柱层析脱盐凝胶柱层析脱盐1415数学模型 Vo Vi VtViVi——凝胶孔内水（内水）凝胶孔内水（内水）VoVo——颗粒间水（外水）颗粒间水（外水）VgVg——凝胶体积凝胶体积总体积总体积VtVt= = Vi Vi + +VoVo+ +VgVgKdKd —— 分配系数：精确衡量混合物中某一待分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一个函数个函数VeVe——洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积液体积 K Kd d=(V=(Ve e-V-Vo o)/V)/Vi i 洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度度/ /吸光度为纵坐标作图吸光度为纵坐标作图（（1 1）完全被排阻的极端大分子，）完全被排阻的极端大分子，VeVe= =VoVo，，KdKd=0=0（（2 2）中等分子，）中等分子，VeVe= =VoVo+ +KdKd··ViVi，，0<0

层析柱保持垂直2 2、放蒸馏水，排出空气，关闭出口放蒸馏水，排出空气，关闭出口3 3、加入搅拌均匀的、加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液，调节流速悬液，调节流速10滴滴/min，，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至使凝胶均匀沉降，不断补充，直至18cm4、、上留上留1-2mm的水，关闭出口的水，关闭出口 注意：注意：注意：注意：★★ 床面上要保持少许床面上要保持少许水，水，防止胶床露出液面防止胶床露出液面防止胶床露出液面防止胶床露出液面 ★ ★ 胶面不平胶面不平胶面不平胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降， 使表面平整使表面平整19▲ ▲ 加样与洗脱加样与洗脱▲ ▲ 凝胶的再生凝胶的再生1、加样：、加样：用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样品用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样品 溶液渗入凝胶溶液渗入凝胶2、洗脱：、洗脱：加入洗脱液，打开出口，保持流速加入洗脱液，打开出口，保持流速10滴滴/min，，收收 集洗脱液，每管收集集洗脱液，每管收集1ml。

用用奈氏试剂奈氏试剂奈氏试剂奈氏试剂检测检测检测检测NHNH4 4++3、保存：、保存：20%20%20%20%璜基水杨酸溶液璜基水杨酸溶液璜基水杨酸溶液璜基水杨酸溶液检测洗脱液的蛋白质检测洗脱液的蛋白质检测洗脱液的蛋白质检测洗脱液的蛋白质，保存，保存 含量高的进一步纯化含量高的进一步纯化 不断加洗脱液，使不断加洗脱液，使NHNH4 4+ +全部流出，为下次实验做准备全部流出，为下次实验做准备20脱盐脱盐 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10②②上样上样γ－球蛋白，－球蛋白， 粗提液粗提液 ①①装柱装柱 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-25，， 柱高柱高18-20cm流速：每分钟流速：每分钟10滴左右滴左右 ③③③③加入洗脱剂加入洗脱剂加入洗脱剂加入洗脱剂④④收集收集 20滴换滴换一支试管一支试管21⑤⑤. .层析后洗脱液检测层析后洗脱液检测¡白色比色板白色比色板, ,洗净备用洗净备用¡一块在各孔滴加奈氏试剂（检测一块在各孔滴加奈氏试剂（检测NHNH4 4+ +））, ,另一块另一块滴加滴加20%20%璜基水杨酸（检测蛋白质）。

璜基水杨酸（检测蛋白质）¡不用滴管不用滴管, ,避免污染避免污染, ,直接倒直接倒……¡用用““-”-”表示无现象，用表示无现象，用““+”, “++”, +”, “++”, “+++”“+++”等表示颜色深浅等表示颜色深浅⑥ ⑥ 回收凝胶回收凝胶22注意事项：注意事项： 1 . 凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏 2. 加样分离时，滴速越慢，分离效果越好加样分离时，滴速越慢，分离效果越好★★ 以管号为横轴，蛋白以管号为横轴，蛋白质含量为纵轴绘制洗脱质含量为纵轴绘制洗脱曲线，分析实验结果曲线，分析实验结果23三、三、DEAEDEAE－－纤维素离子交换层析纤维素离子交换层析 【【实验目的实验目的】】 1. 1. 通过使用通过使用DEAEDEAEDEAEDEAE－－－－纤维素离子交换层析法，纤维素离子交换层析法，纤维素离子交换层析法，纤维素离子交换层析法，进一步进一步 纯化纯化γ-γ-球蛋白脱盐液，得到较纯的球蛋白脱盐液，得到较纯的γ-γ-球蛋白溶液球蛋白溶液 2. 2. 学习了解离子交换层析方法的基本原理和应用学习了解离子交换层析方法的基本原理和应用24离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理 离子交换层析是一种常用的、通过使用各种类型的离离子交换层析是一种常用的、通过使用各种类型的离子交换剂达到分离纯化目的的层析方法。

离子交换剂是通子交换剂达到分离纯化目的的层析方法离子交换剂是通过化学反应将带电基团引入到惰性支持物上形成的固体物过化学反应将带电基团引入到惰性支持物上形成的固体物质，在实验中作为固定相如果其带负电，则能结合阳离质，在实验中作为固定相如果其带负电，则能结合阳离子，成为子，成为阳离子交换剂阳离子交换剂；如果其带正电，则能结合阴离子，；如果其带正电，则能结合阴离子，称为称为阴离子交换剂阴离子交换剂可根据实验需要，选择不同的离子交可根据实验需要，选择不同的离子交换剂进行离子交换层析换剂进行离子交换层析 DEAE DEAE （（二乙基氨基乙基）－纤维素二乙基氨基乙基）－纤维素含有可离子化的碱含有可离子化的碱基，可与氢离子结合，成为带正电荷的阴离子交换剂基，可与氢离子结合，成为带正电荷的阴离子交换剂 25DEAEDEAE－－纤维素离子交换层析纯化纤维素离子交换层析纯化γγ－－球蛋白球蛋白 血清血清α、、β、、γ－－球蛋白、清蛋白的等电点为：球蛋白、清蛋白的等电点为： 清蛋白清蛋白pI= =4.64，， α2球蛋白球蛋白 pI= =5.06，， β球蛋白球蛋白pI= =5.12，， γ球蛋白球蛋白pI= =7.3 本本实实验验采采用用0.0175 mol/l pH6.5 NH4Ac缓缓冲冲液液进进行行洗洗脱脱。

此此pH，，DEAE带带正正电电荷荷，，可可与与带带负负电电荷荷的的α、、β-球球蛋蛋白白和和清清蛋蛋白白结结合合，，而而带带正正电电荷荷的的γ-γ-球球蛋蛋白白不不与与DEAEDEAE结结合合，，首首先先从从层层析析柱柱中中洗洗脱脱出出来来，，首首先先收收集集到到的的既是纯化的既是纯化的γ-球蛋白26操操 作作 将脱盐后的球蛋白加于将脱盐后的球蛋白加于DEAE柱上（方法同柱上（方法同凝胶过滤），用凝胶过滤），用0.0175 mol/l pH 6.3 NH4Ac缓冲液洗脱，流速缓冲液洗脱，流速10滴～滴～15滴滴/分，用小试管连分，用小试管连续收集流出液（约续收集流出液（约1.0 ml/管），用管），用20%20%磺基水杨磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况酸溶液检查蛋白质分布情况，收集含量最高的部，收集含量最高的部分，浓缩作纯度鉴定用该缓冲液洗脱下来的是分，浓缩作纯度鉴定用该缓冲液洗脱下来的是γ－－球蛋白27１１. .使用离心机的操作注意事项使用离心机的操作注意事项２２. .装柱时检查是否漏水装柱时检查是否漏水３３. .装柱后凝胶装柱后凝胶均一无断层，无气泡，柱床面平整均一无断层，无气泡，柱床面平整。

４４. .柱床面保持有缓冲液柱床面保持有缓冲液５５. .加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整６６. .每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被测样品交叉污染测样品交叉污染28四、四、γγ－－球蛋白纯化液的浓缩球蛋白纯化液的浓缩 利用葡聚糖凝胶富含羟基，吸水，不允许大利用葡聚糖凝胶富含羟基，吸水，不允许大分子蛋白进入微孔的特性，在样品溶液中加少量分子蛋白进入微孔的特性，在样品溶液中加少量凝胶，离心，浓缩蛋白凝胶，离心，浓缩蛋白 每每mlml纯化纯化γγ－－球蛋白溶液加球蛋白溶液加SephadexSephadex G-25 0.25 g G-25 0.25 g，，摇动摇动2 2～～3 3分钟，离心分钟，离心3000r/min3000r/min，，5 5分钟，上清即为浓缩分钟，上清即为浓缩γ-γ-球蛋白（或用冷冻干燥仪使其浓缩）球蛋白（或用冷冻干燥仪使其浓缩） 29五、五、γγ－－球蛋白鉴定球蛋白鉴定 用用醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳的方法，以的方法，以血清电泳图谱为对照，鉴定所分离的蛋血清电泳图谱为对照，鉴定所分离的蛋白质种类和纯度（参见血清蛋白质醋酸白质种类和纯度（参见血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳）。

纤维素薄膜电泳） 30蛋白质的电离示意图蛋白质的电离示意图 31基本原理基本原理1 1、以醋酸纤维薄膜作为支持体的一种电泳方法以醋酸纤维薄膜作为支持体的一种电泳方法2 2、在、在pH8.6pH8.6巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中均带负电荷，向正极移动均带负电荷，向正极移动3 3、带电荷多、分子量相对小的泳动速度快；带电荷、带电荷多、分子量相对小的泳动速度快；带电荷少、分子量相对大的泳动速度慢少、分子量相对大的泳动速度慢 32血清蛋白质乙酸纤维血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳素薄膜电泳33  清蛋白清蛋白 1 2    加样线加样线加样线加样线纯化蛋白纯化蛋白对照对照样品样品醋酸纤维素薄膜电泳鉴定醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 点样点样 ：：全血清：点样一次全血清：点样一次 脱盐后的粗蛋白溶液：点样脱盐后的粗蛋白溶液：点样3 3～～5 5次次 浓缩后的纯浓缩后的纯γγ－－球蛋白溶液：点样球蛋白溶液：点样3 3～～5 5次次 35醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳电泳条件电泳条件：： 电压：电压：电压：电压：9090－－－－110 V110 V；；；； 时间：时间：时间：时间：5050分钟。

分钟染染 色色：：电泳毕，关电源取出薄膜浸入盛有氨基电泳毕，关电源取出薄膜浸入盛有氨基黑黑10B10B染色液的染色缸中染色染色液的染色缸中染色5 5分钟，用分钟，用2.5 %2.5 %醋酸洗脱醋酸洗脱液漂洗，直至背景呈白色以血清蛋白图谱为对照，液漂洗，直至背景呈白色以血清蛋白图谱为对照，观察提纯物属哪种蛋白，其纯度如何？观察提纯物属哪种蛋白，其纯度如何？ 36操作步骤：操作步骤：1 1、装置电泳箱区分电泳箱正负极、装置电泳箱区分电泳箱正负极 2 2、点样：浸于巴比妥溶液中的薄膜，滤纸轻轻吸、点样：浸于巴比妥溶液中的薄膜，滤纸轻轻吸 干干 — — 半干燥态半干燥态 铅笔标记；点样器沾适量新鲜血清，垂直点样铅笔标记；点样器沾适量新鲜血清，垂直点样3 3、放入电泳槽，使膜保持水平放入电泳槽，使膜保持水平4 4、通电：、通电：110110伏，伏，1 1小时断电后，取膜断电后，取膜5 5、染色：氨基黑、染色：氨基黑10B10B染色染色5min5min6 6、漂洗：漂洗液浸洗、漂洗：漂洗液浸洗3 3次，每次次，每次5-10min5-10min快快37+铅笔标记铅笔标记 ，垂直点样，垂直点样保持膜不下垂保持膜不下垂保持膜不下垂保持膜不下垂半干燥半干燥半干燥半干燥态态态态38Ø 按泳动快慢顺序分为按泳动快慢顺序分为：：清蛋白、清蛋白、清蛋白、清蛋白、αααα1 1 1 1、、、、αααα2 2 2 2、、、、ββββ、、、、γ—γ—γ—γ—球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白。

39注意事项：注意事项：1 1、区分电泳槽正负极区分电泳槽正负极2 2、点样处放在负极端，保持膜水平点样处放在负极端，保持膜水平3 3、点样面朝下，以防样品蒸发点样面朝下，以防样品蒸发。