原核表达载体.docx

原核表达载体调控原件1. 启动子启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列， 它是基因表达不可缺少的重要调控序列没有启动子，基因就不能转录 由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用 的启动子必须是原核启动子 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要在转录起始点上游 5〜10 bp 处，有一段由6〜8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow盒，又 名TATA盒或一 10区来源不同的启动子，Pribnow盒的碱基顺序稍有变 化在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由10 bp组成的区域，称为 -35区转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子35区与RNA聚合 酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近 DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以 后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的 RNA链原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac（乳糖启动子）、Trp（色氨酸启动子）、Tac（乳 糖和色氨酸的杂合启动子）、lPL （l噬菌体的左向启动子）、T7噬菌体启 动子等。

2. SD序列1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点， 它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3〜10 bp处的由3〜9 bp组成 的序列这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与 16S rRNA 3©末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点以后将此序列命名为 Shine-Dalgarno序列，简称SD序列它与起始密码子AUG之间的距离是影 响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与 SD序列结合也 会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译另外，真核基因的 第二个密码子必须紧接在ATG之后，才能产生一个完整的蛋白质3 •终止子在一个基因的3C末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序 列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子 （terminator）转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进， RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来 对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一 段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C富含区域又具有回文对称结 构。

这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构，并且有与A/T富含区对应的一串U转录终止的机制较为复杂，并且结论尚不统一但在构建表达 载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性， 一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的 rrB核糖体RNA的转录终止子编辑本段原核表达载体构建1. 获得目的基因（1） 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点）， PCR循环获得所需基因片段2） 通过RT-PCR方法：提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物2. 构建重组表达载体（1） 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收 Kit或冻融法回收载体大片段2） PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体3. 获得含重组表达质粒的表达菌种（1） 将连接产物转化大肠杆菌DH5 a，根据重组载体的标志（抗Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定2） 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。

否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点3） 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。