农杆菌电击感受态的制备转化及验证.docx

农杆菌电击感受态的制备，转化及验证1. 制备农杆菌电转感受态(1) 挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素 100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜⑵将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的LB培养基中，28'C, 220rpm震荡3-4 小时，至 OD560=0.5 左右3) 5000rpm离心5分钟，去上清⑷ 加入40m1 10%甘油悬浮菌体，冰浴30min.(5) 4'C, 5000rpm 离心 5 分钟，去上清6加入30mL10%甘油重悬浮菌体，4'C, 5000rpm离心5分钟，(7)重复步骤6 一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(200 p 1/ 管)备用2 农杆菌感受态的电转化〔I)取2 ul质粒加到200 u I EHA 105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 分钟2) 把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化3) 马上加入lml新鲜的LB液体培养基，28'C, 150rpm轻摇4-6小时4) 收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培 养基平板上，28°C培养2-3天。

其实和大肠杆菌电转化差不多，只不过培养温度是28度，摇的时间 长一些，还有就是链霉素和利福平两种抗生素要加上，目的是防止根癌脓杆菌自 带质 粒的丢失，不过具体要加哪些抗生素还得看你是那种根癌脓杆菌非常感谢我用的不是电 转化 是把 茎和叶浸在农杆菌液里 30 秒..想知道为什么不是把菌液直接滴在土里?可以 采用注射法导入农杆菌 还有就是把植株取出放入侵染液中 用真空渗透法导入感受态制备及转化 方案二1、 农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、 农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线(或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str； EHA105： Rif或Str； GV3103:庆大霉素如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的 Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性)，抗生素浓度为：50yg/ml28C培养3、 农杆菌感受态细胞的制备：1) 挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28C振荡培养至0D600 =0.52) 吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3) 5000 (13000) rpm离心30s，弃去上清液；4) 沉淀用 1.5 ml 0.5M NaCl 悬浮，冰浴 20min；5) 5000 (13000) rpm离心30s，弃去上清液；6) 每管用100山20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4°C保存48 小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一 70C保存。

使用时从一 70C取出，置冰 上融化后使用4、DNA直接转化农杆菌：1） 50山农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1〜1阴（5 —10ul）,之后冰浴30 min；2） 放入液氮中5min （或1min），然后立即放入37C水浴锅中水浴5min；3） 取出离心管，加入0.5mlLB, 28C、220rpm振荡培养3〜5hr；4） 取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28C条件下倒置培养2天左右 菌落可见pEmu 载体：AMP+Rif/Str； pK 载体：Kan + Rif/Str； pTCK 载体：Kan + Rif/StrA.农杆菌转化子的PCR鉴定挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50pg/ml Kan amycin的YM液体培养基中,28C，220rpm摇培16hr，直接用菌液做PCRPCR反应体系如下：反应组分体积终浓度母液浓度农杆菌转化子菌液2山P1 (35S)2山200nM2pMP2 (GUS)2山200nM2pM10xPCR Buffer2plMg2+1即1.5mM25mMd NTP1即150|jM2.5mMTaq 酶0即1U5U/plH2O9如20山PCR反应参数设置如下：94C预变性3min后开始以下循环反应：94C变性30 秒，50C退火1min，72C延伸1min, 35个循环后，72C延伸10min。

反应结 束后，取10山反应液在1.0 %琼脂糖凝胶中电泳扩增产物B.农杆菌转化子的酶切鉴定提取农杆菌质粒DNA（同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌， 再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。