色谱分析在药物分析中的运用.ppt

色谱分析在药物分析中的运用2005年1月1 1一、概述n n色谱学已发展成为一个独立的学科n n医药领域是色谱应用的重要领域之一n n液相色谱目前在常规分析仪器中的排列2 2色谱学已发展成为一个独立的学科n n色谱作为分离分析学科，已有近一个世纪的发展色谱作为分离分析学科，已有近一个世纪的发展过程进入过程进入2020世纪以来，科学技术有了飞速发展，世纪以来，科学技术有了飞速发展，色谱学已发展成为一个独立学科，形成了薄层色色谱学已发展成为一个独立学科，形成了薄层色谱、气相色谱、液相色谱、离子色谱、超临界流谱、气相色谱、液相色谱、离子色谱、超临界流体色谱、亲合色谱、疏水色谱、毛细管电泳和电体色谱、亲合色谱、疏水色谱、毛细管电泳和电色谱等许多分支色谱等许多分支n n各种色谱仪与质谱，红外核磁等技术联用仪器已各种色谱仪与质谱，红外核磁等技术联用仪器已成为令人瞩目的高新技术产品成为令人瞩目的高新技术产品3 3医药领域是色谱应用的重要领域之一n n在药物分析中，利用色谱分析方法显得更为重要，尤其是在药物分析中，利用色谱分析方法显得更为重要，尤其是高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC）是目前药物分析中最常用的分）是目前药物分析中最常用的分析手段。

它主要用于复杂成分、混合物的分离，即可用来析手段它主要用于复杂成分、混合物的分离，即可用来作药物的定性、定量及杂质检查作药物的定性、定量及杂质检查n n由于高效液相色谱法分析样品的范围不受沸点、热稳定性、由于高效液相色谱法分析样品的范围不受沸点、热稳定性、相对分子质量大小及有机物与无机物的限制，使其应用范相对分子质量大小及有机物与无机物的限制，使其应用范围极广n n一般说来，只要能将样品制成溶液，就可分析且分离速一般说来，只要能将样品制成溶液，就可分析且分离速度快，灵敏度高，色谱柱可反复使用，可选择的流动相比度快，灵敏度高，色谱柱可反复使用，可选择的流动相比气相色谱法多流出组分不被破坏，且容易收集，可在室气相色谱法多流出组分不被破坏，且容易收集，可在室温下操作，绝大部分药物均可用高效液相色谱法来作温下操作，绝大部分药物均可用高效液相色谱法来作 4 4液相色谱目前在常规分析仪器中的排列n n在2000年版一、二部药典中，用高效液相色谱法测定的品种比1995年版药典成倍地增加，2005年版一、二部药典又增加几倍而高效液相色谱法在几种仪器分析方法中，其分析数量的排列为第二，因其分离效率高，又能准确地反映所测成分的真实含量。

中国药典应用高效液相色谱法的情况，目前仅次于美国药典，而优于英国药典和日本药局方5 5二、共同探讨高效液相色谱在实际操作中的部分问题n n高效液相色谱方法的建立高效液相色谱方法的建立n n色谱分离类型的选择色谱分离类型的选择n n溶剂的选择溶剂的选择n n溶剂纯化溶剂纯化n n溶剂的脱气溶剂的脱气n n样品溶剂的选择样品溶剂的选择n n检测器的选择检测器的选择n n系统适应性试验系统适应性试验n n无参比标准的纯度评价无参比标准的纯度评价n nHPLCHPLC在药物分析中的应用范围在药物分析中的应用范围6 6高效液相色谱方法的建立n n应用HPLC对样品进行分离、分析，主要根据样品的性质，选择合适的分离类型及所用的色谱柱和流动相、检测器等n n（一）样品的性质n n样品中待测组分的分子量大小、化学结构、溶解性等化学、物理性质决定着色谱分离类型的选择7 7色谱分离类型的选择n n高效液相色谱的各种方法有其各自的特点和应用范围，应根据分离分析的目的，样品的性质和含量、现有的设备条件等选择合适的方法通常分离类型应根据样品的性质（如相对分子质量的大小，化学结构，溶解性及极性等）来选择，并根据此条件选择色谱柱和流动相。

8 8溶剂的选择n n在高效液相色谱分析中，流动相的种类、配比，对色谱分离效果影响很大，可供选择的固定相填料种类较少因此，流动相的选择显得自关重要n n（1）溶剂纯度要高 n n（2）不能引起柱效损失或保留特性变化 n n（3）常用固定相与流动相的选择 n n（4）溶剂系统的选择常用n n（5）缓冲系统及缓冲溶液的处理 9 9溶剂纯化n n在HPLC分离测定中，溶剂的纯度是很关键的溶剂足够纯才不至于产生问题，对溶剂纯度的要求依应用情况而定1010溶剂的脱气n n液相色谱仪的检测器常被溶剂中的气泡干扰，气液相色谱仪的检测器常被溶剂中的气泡干扰，气泡的形成是由于被空气饱和的溶剂从高压流向低泡的形成是由于被空气饱和的溶剂从高压流向低压，如柱出口，这些气泡形成干扰检测器光学道压，如柱出口，这些气泡形成干扰检测器光学道路的折射表面因此，限制气泡和伴随的噪音的路的折射表面因此，限制气泡和伴随的噪音的常用办法是在用前从溶剂中除去气泡常用的脱常用办法是在用前从溶剂中除去气泡常用的脱气方法有真空泵脱气法和煮沸脱气法气方法有真空泵脱气法和煮沸脱气法n n1 1．真空泵脱气．真空泵脱气 n n2 2．煮沸脱气法．煮沸脱气法n n3 3．溶剂的滤过．溶剂的滤过1111样品溶剂的选择n n样品的溶剂应对样品溶解性大，且对样品稳定并与检测器相匹配，最好与流动相相同，这样可允许大量的进样量，但待测物的洗脱不应受影响，当样品溶剂与流动相不同时，则会出现样品溶剂的峰。

12121313缓冲溶剂的注意事项n n色谱柱使用的流动相pH值范围为2.5～7.5为宜酸性太强会使键合的烷基脱落，碱性太强会使硅胶溶解，通常用缓冲液维持一定的pH值缓冲液浓度范围为0.005～0.5mol/L，尽量用稀溶液为好，在用水和有机溶剂系统中，应注意盐的存在会改变溶剂的可混合性，在色谱分离过程中，绝不能发生相的分离和盐的沉淀在HPLC中，最常用的缓冲溶液是醋酸盐和磷酸盐缓冲液1414检测器的选择n nHPLC检测中，当样品有紫外吸收时，常选用紫外检测器，在药物分析文献中，用紫外检测器的占95%以上，使用时要注意溶剂的使用波长，即溶剂的极限波长必须低于检测波长若使用荧光检测器或电化学检测器，可使灵敏度提高2～3个数量级，但不是所有化合物都有荧光，无荧光的物质可经衍生化作用形成荧光的化合物电化学检测适用于有氧化还原性的药物1515系统适应性试验n n当选用当选用HPLCHPLC方法后，不同操作者各实验室之间实方法后，不同操作者各实验室之间实验数据的重现性应引起注意在验数据的重现性应引起注意在HPLCHPLC中，很难实中，很难实现很好的重现性，因有许多具有相同名称的填料，现很好的重现性，因有许多具有相同名称的填料，由于生产厂家不同，性质也不尽相同。

有许多由于生产厂家不同，性质也不尽相同有许多HPLCHPLC填料或柱随着使用而变坏，其原因是填料的填料或柱随着使用而变坏，其原因是填料的水解或柱死体积因填料溶解而增加，因此面临着水解或柱死体积因填料溶解而增加，因此面临着色谱柱是否与建立方法时的柱效相同的问题色谱柱是否与建立方法时的柱效相同的问题n n当用当用HPLCHPLC方法时，系统要有合适的性能，系统性方法时，系统要有合适的性能，系统性能受所用的色谱柱和溶剂的影响，通常用分离度，能受所用的色谱柱和溶剂的影响，通常用分离度，理论板数和峰拖尾因子等几个基本参数来测定系理论板数和峰拖尾因子等几个基本参数来测定系统性能1616n n峰形状是用于控制系统适用性的另一色谱参数，监测峰形峰形状是用于控制系统适用性的另一色谱参数，监测峰形的重要方法之一是测定理论板数，但因用峰宽或半峰宽的的重要方法之一是测定理论板数，但因用峰宽或半峰宽的计算不能表示峰是否拖尾，所以用于测量理论板数的方法计算不能表示峰是否拖尾，所以用于测量理论板数的方法并不标准，而在系统适用性试验中，峰拖尾程度可以作为并不标准，而在系统适用性试验中，峰拖尾程度可以作为衡量柱效的另一指标，峰拖尾程度用拖尾因子表示。

拖尾衡量柱效的另一指标，峰拖尾程度用拖尾因子表示拖尾因子（因子（T T）定义为：）定义为：n n式中式中W0.05hW0.05h为为0.050.05倍峰高处的峰宽；倍峰高处的峰宽；d1d1为峰的前沿到为峰的前沿到峰出现极大值时的水平距离，如图峰出现极大值时的水平距离，如图1717n n中国药典中国药典20002000年版和年版和usp(24)usp(24)n n均规定在峰高均规定在峰高5%5%处测定峰宽处测定峰宽n n由于噪音及其他因素影响基线的由于噪音及其他因素影响基线的n n稳定性峰高稳定性峰高5%5%处的峰宽值易受处的峰宽值易受n n其影响，从而干扰测定结果，有其影响，从而干扰测定结果，有n n人在峰高人在峰高10%10%处测定，重现性较处测定，重现性较n n好峰拖尾程度对柱死体积和柱填料的变化很敏感，因此好峰拖尾程度对柱死体积和柱填料的变化很敏感，因此可作为衡量柱能否再用的标准总之，柱性能是否处于良可作为衡量柱能否再用的标准总之，柱性能是否处于良好水平，可使用关键的参数（如校正线的斜率，理论板数好水平，可使用关键的参数（如校正线的斜率，理论板数和峰拖尾程度来衡量当这些参数超过允许范围时，就不和峰拖尾程度来衡量。

当这些参数超过允许范围时，就不应再用此柱进行实验应再用此柱进行实验1818无参比标准的纯度评价n nHPLC已成为鉴定药物纯度的主要工具，用于鉴别和检查样品中的杂质，首先要求分离完全，为此要选择合适的色谱条件将杂质、降解产物与主分分离，评价杂质的主要问题是杂质的定量，可在相同的色谱条件下将杂质的峰面积与已知浓度的对照品的峰面积进行比较，但通常杂质是未知的，因此为测定样品中未知杂质的浓度，就需要做一些假设1919HPLC在药物分析中的应用范围n nHPLCHPLC法在药物分析中常用于药物的鉴别和检查法在药物分析中常用于药物的鉴别和检查n n1 1、利用已知物对照法定性、利用已知物对照法定性n n2 2、色谱法与其他方法结合定性、色谱法与其他方法结合定性n n（（1 1）利用化学反应定性）利用化学反应定性n n（（2 2）利用二极管阵列检测器来测定各组分的紫外）利用二极管阵列检测器来测定各组分的紫外吸收光谱吸收光谱n n（（3 3）收集峰的流出物，经浓缩蒸除溶剂，进行）收集峰的流出物，经浓缩蒸除溶剂，进行IR.MSIR.MS和和NMRNMR鉴别 n n（（4 4）液）液- -质联用仪质联用仪n n3 3、定性分析、定性分析2020定性分析n n1 1、利用已知物对照法定性、利用已知物对照法定性n n2 2、利用保留特性、利用保留特性n n3 3、色谱法与其他方法结合定性、色谱法与其他方法结合定性 n n（（1 1）利用化学反应定性）利用化学反应定性 n n（（2 2）利用二极管阵列检测器来测定各组分的紫外）利用二极管阵列检测器来测定各组分的紫外吸收光谱。

吸收光谱n n（（3 3）收集峰的流出物，经浓缩蒸除溶剂，进行）收集峰的流出物，经浓缩蒸除溶剂，进行IR.MSIR.MS和和NMRNMR鉴别n n（（4 4）液）液- -质联用仪质联用仪 2121定量分析n n1 1、校正因子、校正因子n n2 2、定量分析方法的种、定量分析方法的种类类n n（（1 1）峰面积归一化法）峰面积归一化法n n（（2 2）外标法）外标法n n（（3 3）内标法）内标法2222三、微柱色谱实用性进展n n微柱液相色谱法与普通液相色谱法的比较n n微柱液相色谱的应用范围2323微柱液相色谱法的实用性进展n n微柱液相色谱法与普通液相色微柱液相色谱法与普通液相色谱的比较谱的比较n n分类分类n n应用应用n n快速药物分析快速药物分析n n在药物分析中，复方制剂分析在药物分析中，复方制剂分析和治疗药物监测非常适合用微和治疗药物监测非常适合用微柱，进行快速分析分析柱，进行快速分析分析APCAPC片中的片中的3 3种主药，用种主药，用100mm×1mm100mm×1mm微柱，填充微柱，填充3µm3µm的的ODSODS，用乙腈，用乙腈- -5mmol/L5mmol/L辛基磺酸钠溶液辛基磺酸钠溶液（（18:2018:20）为流动相，）为流动相，20s20s内分内分离即完毕，离即完毕，5050个样品个样品15min15min内内即完成。

流动相只需即完成流动相只需14ml14ml，为，为常规柱的常规柱的1/211/212424微柱液相色谱法的实用性进展n n微柱液相色谱法与普通液相色谱的比较微柱液相色谱法与普通液相色谱的比较n n分类分类n n应用应用n n快速药物分析快速药物分析n n在药物分析中，复方制剂分析和治疗药物监测非常在药物分析中，复方制剂分析和治疗药物监测非常适合用微柱，进行快速分析分析适合用微柱，进行快速分析分析APCAPC片中的片中的3 3种种主药，用主药，用100mm×1mm100mm×1mm微柱，填充微柱，填充3µm3µm的的ODSODS，用乙腈，用乙腈-5mmol/L-5mmol/L辛基磺酸钠溶液（辛基磺酸钠溶液（18:2018:20）为）为流动相，流动相，20s20s内分离即完毕，内分离即完毕，5050个样品个样品15min15min内内即完成流动相只需即完成流动相只需14ml14ml，为常规柱的，为常规柱的1/211/212525谢谢2626。