同步荧光法.docx

同步荧光法测定维生素B1，B2，B6含量的条件研究陆栋，何姗姗（浙江大学药学院）摘要：本文研究了同步荧光法同时测定药物中维生素B1，B2，B6的测定条件以⊿λ=25nm进行同步扫描所得到的三个同步荧光峰（以发射波长表示，分别位于412nm，509nm，379nm）可以同时分别测定维生素B1，B2，B6方法快速，灵敏在最佳实验条件下，维生素B1，B2，B6的工作曲线线性范围分别为0.5~4ug/ml，0.25~2ug/ml，0.04~0.3ug/ml关键字：同步荧光法，维生素B1，维生素B2，维生素B6维生素B2，B6本身为荧光物质，维生素B1在碱性介质中发生硫色素反应生成硫胺荧后也可产生强荧光，三者常共存于同一样品中，所以三者的同时测定一直是荧光分析领域所探讨的课题荧光技术尽管灵敏度高，但对一些复杂混合物，比如维生素B1，B2，B6混合样品，其分析常遇到光谱互相重叠，不易分辨的困难，需要预分离后逐个分别测定，步骤繁琐本文利用同步荧光法使其三者的光谱简化，普带变窄，提高选择性，减少光散射干扰等特点，得到了可以同时测定三者的同步荧光光谱，并考察了在最佳实验条件下的线性范围，建立了一个快速，简便的荧光分析步骤。

实验部分1.仪器和试药JASCO FP-6500荧光光谱仪，BOLONG USC-302超声仪，TELTA320 pH计，维生素B1，维生素B2，维生素B6：生化试剂，均为浙江大学药学院药物分析实验中心提供复合维生素B片：含维生素B1 3mg/片，维生素B2 1.5mg/片，维生素B6 0.2mg/片，批号 20101101维生素B1（盐酸硫胺素）标准液：准确称取100mg硫胺素，用水定容至100ml，浓度为1mg/ml（溶液在棕色瓶中于5℃冷藏）放在棕色瓶中冷藏备用维生素B2(核黄素) 标准液：准确称取50mg核黄素溶解于稀盐酸溶液中并定容至500ml，浓度为100ug/ml放在棕色瓶中冷藏备用维生素B6（吡多辛）标准液：准确称取50mg维生素B6，用水定容至500ml，浓度为100ug/ml的贮备液，放在棕色瓶中冷藏备用1%铁氰化钾溶液：称取铁氰化钾溶液0.1g，用水稀释至10ml15%氢氧化钠溶液：称取7.5g氢氧化钠，定容至50ml磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液：将0.2M磷酸氢二钾溶液与0.1M柠檬酸溶液按体积比6:1混合，用柠檬酸溶液调节至pH=7.0 （Na2HPO4 ：174.14； 柠檬酸：192.14）2.实验方法取维生素B待测液适量于50毫升容量瓶中，加入缓冲液至10毫升，加入1毫升15%氢氧化钠溶液和0.5毫升1%铁氰化钾溶液，摇匀，置于暗处1小时，摇动下加入稀硫酸至中性（用酚酞指示）。

用缓冲液定容至刻度，摇匀于下列仪器条件下进行荧光扫描及测定BANDPASSEx：10nm EM ：10nm ，SCAN SPEED：200nm／min，PM (能量增益)：low，RE—SPONSE：2s，BOTH SCAN：SET从同步扫描确定波长差⊿λ=25nm，V B1 387nm／412nm，VB2 484nm／ 509nm，VB6 354／379nm，为最佳测定波长测得同步荧光值，由各自工作曲线计算其含量结果与讨论1.光谱扫描VB6VB1VB2取维生素B标准液各1ml分别置于10ml容量瓶中，按实验方法处理于λeλ300—600nm进行扫描，测绘各自的激发光谱和发射光谱（图1）维生素B1， B6的荧光激发峰分别位于373nm和326nm，维生素B2的荧光激发峰有337nm，403nm，493nm（最强）三个维生素B1，B2，VB6B6的荧光发射峰分别位于443nm，531nm，392nmVB1VB2 图1 维生素B1，B2，B6激发光谱（上）和发射光谱（下）2.波长差⊿λ选择各取维生素B1，B2，B6 0.5ml，2ml，10ml于50ml容量瓶中，按实验方法处理后，选择不同⊿λ值（⊿λ=10,20,25,30,40,50,60nm）扫描得其同步荧光光谱（图2）。

结果表明随着⊿λ的增大，荧光信号也随之增大，但分离效果变差，综合分离效果和荧光信号强度两个条件，本实验选择⊿λ=25，如图3所示，此时三者明显分开，而且灵敏度较好图2 波长差⊿λ对同步荧光光谱的影响 10nm 20nm 25nm 30nm 40nm 50nm 60nmB2B1B6图3 维生素B1、B2和B6的同步荧光光谱（⊿λ=25）3.荧光稳定性考察取等量的维生素B1、B2和B6标准混合液于一系列10ml容量瓶中，按照实验方法处理，其中改变硫色素反应时间，将反应时间与相应的荧光强度作图（图4），考察反应时间与维生素B荧光强度的影响 图4 硫色素反应时间与荧光强度关系图4.工作曲线 取不同量的维生素B1、B2和B6标准混合液于一系列10ml容量瓶中，分别用缓冲液稀释至刻度，配成系列标准溶液（表1）按实验方法操作，获得工作曲线（图5）数据经回归处理荧光信号列于表2浓度（ppm） 图5 维生素B1，B2，B6工作曲线表1 标准溶液的配制1ml750ul500ul250ul125ulVB14ug/ml3ug/ml2ug/ml1ug/ml0.5ug/mlVB22ug/ml1.5ug/ml1ug/ml0.5ug/ml0.25ug/mlVB30.3ug/ml0.225ug/ml0.15ug/ml0.075ug/ml0.0375ug/ml 表2 工作曲线的有关参数组分 线性范围（ug/ml） 回归方程 R2VB1 0.5-4 F=45.44C + 10.63 0.995VB2 0.25-2 F=65.85C + 1.654 0.999VB6 0.04-0.3 F=35.94C + 1.046 0.9985.精密度实验 配制6份维生素B1、B2和B6混合液，按实验方法处理，平行测定，实验结果的RSD分别为4.27%，1.47%，1.44%。

5.样品测定取20片复合维生素B片，称重为1.4669g，精密称定57.99mg于500ml容量瓶中稀盐酸溶解后用缓冲液定容至刻度，摇匀经过滤后取滤液1ml至10ml容量瓶中，按实验方法测定测定结果见表3.表3 复合维生素B片含量测定结果 组分 标示量% VB1 53.2%VB2 102.2VB6 74.8%6.讨论本实验成功测绘了维生素B1，B2，B6的同步荧光光谱图，探索了不同波长差⊿λ对于各组分间的分离效果以及荧光灵敏度的影响，成功得到了最佳⊿λ=25nm，在此基础上考察了硫色素反应时间对于荧光稳定性的影响，以指导选择一个较合理的反应时间，尽量消除反应时间误差所引起的荧光强度误差本次实验的复合维生素B片的含量测定除维生素VB2的含量准确度较高外，维生素VB1，VB6的测定结果准确度都不高我们根据自己实验设计以及相关文献，总结了一下几个方面的影响因素：1.硫色素反应虽为维生素B1的专属性反应，但并不是定量完成，由本实验的稳定性考察中可发现此反应进行的较缓慢，在2小时内都未反应完全，因此可考虑采取一些能加速此反应的措施，或者加入一些表面活性剂来稳定荧光强度。

2.有文献报道过量的Fe3+对VB1的荧光具有猝灭作用, 适量的Fe3+ 对VB1具有增强荧光强度的作用,Fe3+ 则对VB2和VB6的荧光具有不同程度的猝灭作用本实验中的样品所含的VB1量明显低于标准品，可能导致了相同浓度的Fe3+产生了不同的作用，影响了最后的准确度因此在进行硫色素反应时应保证样品与标准品各维生素B的含量相同，可能可以减弱此影响，提高准确度或者换其他氧化剂如氯化汞，溴化氰等，来消除Fe3+对于维生素B荧光强度的影响3.维生素B6在碱性条件下易被破坏，由于硫色素反应需在碱性条件下进行，且为考虑到荧光稳定性使得反应时间较长，从而使维生素B6较长时间存在于碱性条件而遭到了破坏4.复合维生素B片剂中的其他成分对于硫色素反应以及荧光测定具有一定的干扰因为在严格控制铁氰化钾和氢氧化钠用量，以及反应时间后，片剂中维生素B1，B6的荧光强度与标准品仍有较大差距同时精密度实验的结果也从一定程度上论证了这一点5.荧光分析灵敏度较高，且测定干扰因素较多许多实验条件（如铁氰化钾用量，反应时间，氢氧化钠浓度，溶剂pH值，标准液和样品的浓度）都需进行摸索，得到最好的实验条件同时在实验过程中需要很熟练和专业的操作规范，细小的失误都可能会给实验的最终结果带来巨大的误差。

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