宿主细胞和小鼠体内在miR-125b-5p促进下分枝杆菌的存活观察研究.docx

宿主细胞和小鼠体内在miR-125b-5p促进下分枝杆菌的存活观察研究结核病(Tuberculosis,TB)的病原菌结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)能在宿主细胞内寄生、繁殖Mtb侵入机体后可被巨噬细胞表面的受体识别,通过胞吞作用进入巨噬细胞[1]毒性较强的Mtb不但能抑制吞噬体和溶酶体的融合,阻止吞噬细胞对其的杀伤,而且能够调节巨噬细胞的分化和成熟,从而进行免疫逃逸[2]γ干扰素活化的巨噬细胞可促进吞噬体与溶酶体融合来清除细胞,因此,细胞免疫在调控Mtb感染过程中发挥重要作用探究Mtb与宿主细胞的关系,对于深入阐明Mtb的致病机制以及宿主的抗结核免疫具有重要意义microRNA(简称miRNA)是一种约19～22nt长的内源性非编码RNA,通过与靶基因的调控区域结合,在转录后水平降解mRNA或抑制靶基因的翻译,从而调控基因的表达[3]Mtb感染能引起宿主细胞中miRNA表达量发生显著变化以往的研究表明,命名为miR-125b-5p的miRNA在结核病人体内含量显著升高[4,5],但其具体作用机制未知本研究通过观察miR-125b-5p对分枝杆菌在宿主细胞及小鼠体内生长情况的影响,探讨其与结核感染的关系,以期证明miR-125b-5p在抗结核免疫过程中所发挥的作用。

1、材料和方法1.1材料1.1.1菌株和细胞耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis,MS)和牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)卡介苗(BacillusCalmette-Guérinvaccine,BCG)由本实验室保存人肺上皮细胞A549、人巨噬细胞THP-1及鼠巨噬细胞RAW264.7源自中国科学院生化细胞研究所细胞库1.1.2试验动物C57BL/6小鼠,SPF级,7～8周龄,雌性,共12只,购自上海斯莱克实验动物有限公司1.1.3培养基7H9液体培养基和10%OADC增菌液购自BD公司,7H10固体培养基购自BD公司,1640培养基加10%胎牛血清(fatalbovineserum,FBS)购自GIBCO公司1.1.4试剂miR-125b-5p模拟物(miR-125b-5p-mi)、miR-125b-5p抑制剂(miR-125b-5p-in)及其miRNA对照(mi-con、in-con)均购自天根生化科技有限公司,Trizol购自Qiagen公司,miRcutemiRNAFirst-StrandcDNASynthesis试剂盒和miRcutemiRNAq-PCRDetection(SYBRGreen)试剂盒购自天根生化科技有限公司。

表达miR-125b-5p抑制剂的慢病毒购自上海吉凯基因科技有限公司1.1.5引物miR-125b-5p荧光定量聚合酶链反应引物(5′-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUU-3′)和U6引物(5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′)购自天根生化科技有限公司1.2方法1.2.1分枝杆菌的培养和计数分枝杆菌培养采用7H9液体培养基和10%OADC增菌液,在37℃恒温培养箱中进行用7H10固体培养基和10%OADC培养3～4周,然后计算菌落数目1.2.2细胞培养所有细胞都采用1640培养基加10%FBS,于5%CO2和37℃条件下培养1.2.3miRNA转染按照转染试剂Lipo2000的说明书,将终浓度为50nmol/L的miR-125b-5p-mi、miR-125b-5p-in及其对照mi-con、in-con与细胞孵育在孵育后的不同时间点收集细胞,进行实验1.2.4细菌感染细胞在被细菌感染前,用佛波酯(Phorbol12-myristate13-acetate,PMA)以50ng/ml的浓度诱导THP-1细胞分别用分枝杆菌以MOI=10∶1(细菌∶细胞)的比例感染诱导后的THP-1细胞、A549或RAW264.7细胞。

感染4h后,洗掉未被细胞吞噬的细菌根据实验目的在不同的时间点取样,用于提取RNA或microRNA,或者用于菌落计数1.2.5荧光定量聚合酶链反应检测用Trizol裂解细胞,抽提总RNA,用miRcutemiRNAFirst-StrandcDNASynthesis试剂盒进行miRNAcDNA第1链合成用miRcutemiRNAq-PCRDetection试剂盒对miR-125b-5p的表达量进行荧光定量聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)检测,miR-125b-5p的荧光定量PCR引物为5′-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUU-3′荧光定量PCR的反应条件为95℃变性120s;95℃变性15s,60℃退火30s,共40个循环核内小RNAU6作为内参,U6的引物为5′-CTCGCTTCGGCA-GCACA-3′1.2.6分枝杆菌感染小鼠C57BL/6小鼠12只,饲养于上海市肺科医院P2动物房实验组6只小鼠攻毒剂量1.3×107CFU/只,攻毒方式为尾静脉注射;对照组6只小鼠注射等体积的磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline,PBS)。

在分枝杆菌感染后第3天,开始在小鼠后肢足垫注射表达miR-125b-5p抑制剂的慢病毒进行治疗,剂量为5×106TU/只小鼠饲养3周后颈椎脱臼处死,在无菌的超净台内将小鼠解剖,取出肺脏并称重,在研钵中将脏器全部研磨制成匀质的悬液,取300μL细胞悬液抽提RNA,用荧光定量PCR检测miR-125b-5p的表达量肺部病理切片用苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosinstaining)1.3统计学方法实验数据采用GraphPadPrism5软件进行分析两组样本均数检验采用t检验,多组样本均数检验采用单因素方差分析P<0.05为差异具有统计学意义2、结果2.1分枝杆菌感染诱导细胞内miR-125b-5p的上调表达为验证分枝杆菌的感染是否会改变宿主细胞中miR-125b-5p的表达量,首先采用生长速率较快的耻垢分枝杆菌感染人肺上皮细胞A549在感染24h后,荧光定量PCR检测发现miR-125b-5p在感染细胞中的表达量比未感染的细胞提高了约15倍(图1A)随后,用生长速率比较缓慢的牛分枝杆菌BCG感染A549细胞,检测发现感染后的miR-125b-5p表达量比感染前提高了20多倍。

为了验证分枝杆菌感染是否能够提高miR-125b-5p在巨噬细胞中的表达量,分别采用BCG感染人源巨噬细胞系THP-1和小鼠巨噬细胞系RAW264.7发现miR-125b-5p在两种巨噬细胞中的表达量都提高了10倍以上(图1B)上述结果证明分枝杆菌感染能诱导宿主细胞中miR-125b-5p显著上调表达图1分枝杆菌感染不同类型的细胞诱导了细胞内miR-125b-5p的上调表达为了验证分枝杆菌感染是否影响miR-125b-5p在宿主体内的表达量,采用BCG感染C57BL/6小鼠在感染1个月后,提取小鼠脏器内的RNA,反转成cDNA,进行荧光定量PCR检测结果发现,miR-125b-5p在BCG感染小鼠的肺中表达量约为PBS对照组的15倍(图2)结果说明,分枝杆菌感染能够提高miR-125b-5p在小鼠肺中的表达量,即miR-125b-5p表达量与分枝杆菌感染密切相关2.2miR-125b-5p促进分枝杆菌在细胞内生长为验证miR-125b-5p的表达量改变是否影响分枝杆菌在细胞内的生长,用BCG感染吞噬细胞,然后向细胞内转染miR-125b-5p的模拟物或对照培养3d后,裂解细胞裂解液涂板,培养3周后进行菌落计数,发现在模拟物转染的A549细胞中,BCG菌落数目大约是对照组的3倍(图3A,左图)。

与此类似,在模拟物转染的巨噬细胞THP-1和RAW264.7中,BCG的菌落数目都比对照组提高了约2倍(图3A,中、右图)结果说明,转染miR-125b-5p模拟物后,分枝杆菌在细胞内生长、繁殖的速率增加,菌落数目增多用BCG感染吞噬细胞后,再转染miR-125b-5p抑制剂来减低细胞内miR-125b-5p的表达量菌落计数的结果表明,在被抑制剂转染的A549细胞中,BCG菌落数目约是对照组的50%(图3B,左图)同样,在被抑制剂转染的巨噬细胞THP-1和RAW264.7中,BCG的菌落数目都比对照组显著降低(图3B,中、右图)结果说明,在转染miR-125b-5p抑制剂后,分枝杆菌在细胞内的生长数目减少表明miR-125b-5p的表达能够促进分枝杆菌在细胞内的生长图2miR-125b-5p在BCG感染的C57BL/6小鼠肺部的表达水平显著高于对照组图3miR-125b-5p及其抑制剂对细胞内感染的BCG生长的影响2.3miR-125b-5p抑制剂减低分枝杆菌感染小鼠体内的细菌载量为了验证miR-125b-5p是否能够调节分枝杆菌在宿主体内的生长,在BCG感染小鼠后的第4天,注射表达miR-125b-5p抑制剂的慢病毒到小鼠体内。

感染1个月后,解剖小鼠,取脾脏,进行菌落计数结果表明,在注射抑制剂的小鼠脾脏中BCG菌落数目显著低于对照组(P<0.05,图4A)同时,取小鼠的肺部切片进行病理分析,发现对照组小鼠肺部出现了显著的结核病理损伤,而治疗组小鼠肺部的结核病理损伤较少这说明注射表达miR-125b-5p抑制剂的慢病毒在降低小鼠体内miR-125b-5p表达量后能显著抑制分枝杆菌在小鼠体内的生长,减轻肺部病理损伤图4miR-125b-5p的抑制剂治疗BCG感染的C57BL/6小鼠能够显著降低分枝杆菌在脾脏的细菌载量，减轻肺部病理损伤3、讨论microRNA与Mtb感染的发生和发展密切相关microRNA不仅可以作为结核病的生物标志物,而且还与细胞凋亡、自噬以及抗结核免疫调控等密切相关[6]本研究深入探讨了miR-125b-5p在抗结核免疫过程中的作用Mtb是一种胞内寄生菌,主要寄生于宿主的巨噬细胞和肺上皮细胞[7,8,9]因此,选择人肺上皮细胞A549和人巨噬细胞THP-1[10],及小鼠的巨噬细胞RAW264.7进行研究无论用快速生长的耻垢分枝杆菌还是缓慢生长的BCG进行感染,细胞内miR-125b-5p的表达量均显著上调。

感染BCG后,小鼠肺部miR-125b-5p的表达量也显著上调结果证明无论在体内还是体外,分枝杆菌的感染都能诱导miR-125b-5p上调表达,提示miR-125b-5p的表达与分枝杆菌在宿主内生长存在密切关系为了进一步证实miR-125b-5p对分枝杆菌在宿主细胞内生长的作用,分别转染miR-125b-5p模拟物和miR-125b-5p抑制剂,结果发现BCG在细胞中的生长发生显著改变且miR-125b-5p抑制剂能够显著降低BCG感染小鼠体内的细菌载量这表明miR-125b-5p抑制剂具有治疗BCG感染的潜在应用价值,也证明了miRNA具有用于结核病治疗的潜力miR-125b-5p与其他miRNA一样,具有多个靶点,受多种调控,可能通过多个机制调控分枝杆菌的生长[11,12],例如,miR-125b-5p是否能够调控巨噬细胞中吞噬体与溶酶体的融合[13],是否能够调控一氧化氮或维生素D通路相关的杀菌通路[14],是否能影响细胞的自噬或凋亡过程等[15]所以,miR-125b-5p影响分枝杆菌在宿主细胞和小鼠体内生长的作用机制还有待进一步探究,可利用miR-125b-5p敲除的转基因小鼠在系统水平上探究miR-125b-5p对分枝杆菌在宿主体内生长的影响[16]。

参考文献：[6]王杰,刘春法,崔永勇,赵德明,周向梅.结核分枝杆菌感染相关microRNA的研究进展[J。