【最新word论文】藜草花粉变应原免疫活性分析【医学专业论文】.doc

1藜草花粉变应原免疫活性分析作者：张洁，孙秀珍，陈曦，冯向莉，刘艳琴【关键词】哮喘；藜草；花粉；变应原；变应原性；免疫原性Immunoactivityanalysisofalbumpollenallergen【Abstract】AIM:Toanalyseproteincomponentsinalbumpollenandevaluatetheirallergenicityandimmunogenicity.METHODS:ThecomponentsofproteinallergenwerecollectedfromthecrudeextractofchenopodiumalbumpollenwithSephacrylS200HRgelfiltrationforremovingtheimpurities.MolecularweightsofthecomponentsweretestedthroughSDSPAGE.ThenthereactionratesofIgEandIgGinasthmaticpatientsserumtochenopodiumalbumpollenwerecountedbyimmunoblotting.RESULTS:TwelvebandsofproteinwereobtainedthroughSDSPAGE.Themolecularweightofeachbandwas92,63.1,61,52,45,43,39.7,38.9,34,31.6,28.4and18.5~12ku.Immunoblotingidentified4proteinbandsrecognizedbysIgE,molecularweightsbeing92,34,31.6and18.5~12ku,whichreactedwith70%,50%,80%and90%ofasthmaticpatientserum.Eightproteinbandswithmolecularweightsbeing92,61,52,45,43,39.7,31.6and18.5~12kushowedsIgGbindingcapacity,whichreactedwith80%,40%,10%,20%,80%,10%,10%and100%ofasthmaticpatientserum.CONCLUSION:Albumpollencomprises12majorproteincomponents.Componentswithstrongallergenicityandimmunogenicityaretheproteinswithmolecularweightof18.5~12and92ku.Proteinswithmolecularweightof34and31.6kuhavestrongallergenicity,andweakimmunogenicityornot.Proteinswithmolecularweightof61,43,45,52and39.7kupossesscertainimmunogenicity,butnoallergenicity.【Keywords】asthma;chenopodiumalbum;pollen;allergens;allergenicity;immunogenicity【摘要】目的：分析藜草花粉变应原成分及其变应原性、免疫原性.方法：用 SephacrylS200HR 葡聚糖凝胶层析法分离、纯化藜草花粉变应原,通过十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电脉法(SDSPAGE)测定变应原各组分的分子质量；应用免疫印迹法检测各组分蛋白质与藜草花粉过敏性哮喘患者血清中 sIgG 和 sIgE 的反应率.结果：藜草花粉经电泳后得到 12 条蛋白质区带,分子质量依次为92,63.1,61,52,45,43,39.7,38.9,34,31.6,28.4 和 18.5~12ku；免疫印迹可见 4条 sIgE 反应带,蛋白分子质量依次为 92,34,31.6 和 18.5~12ku；与患者血清反应率分别是 70%,50%,80%和 90%；与血清 sIgG 结合的反应带有 8 条,蛋白分子质量为 92,61,52,45,43,39.7,31.6 和 18.5~12ku；与患者血清反应率分别是80%,40%,10%,20%,80%,10%,10%和 100%.结论：藜草花粉变应原主要含 12 种蛋白质成分,其中分子质量为 18.5~12ku 和 92ku 的蛋白质变应原活性及免疫原活性均很强,是主要变应原成分；分子质量在 34 和 31.6ku 的蛋白质有较强的变应原性而无或仅有较弱的免疫原性；而分子质量为 43,61,45,52 和 39.7ku 的蛋白质具2有一定的免疫原性而无变应原性.【关键词】哮喘；藜草；花粉；变应原；变应原性；免疫原性0 引言从气传致敏花粉种类调查中发现,藜草是我国许多地方夏秋季节大气中最常见的气传致敏花粉之一［1］.我们采用 SDSPAGE 分析藜草花粉变应原的蛋白成分,并用免疫印迹的方法,通过观察藜草花粉过敏性哮喘患者的血清结合模式,分析藜草花粉各蛋白成分的变应原性及免疫原性,为藜草花粉变应原的纯化、重组打下基础.1 材料和方法1.1 材料1.1.1 对象自我院变态反应专科门诊患者中选择藜草花粉过敏性哮喘患者10（男 4,女 6）例,年龄 1456(平均 34.1±13.7)岁.支气管哮喘诊断标准依据第四届全国哮喘学术会议制定的《支气管哮喘防治指南》 ［2］.藜草花粉过敏的筛选标准：根据典型的花粉过敏病史；藜草花粉变应原皮肤点刺试验［3］结果≥(一般皮丘≥1.5cm,红斑＞1.0cm).CAP 系统检测哮喘患者血清藜草花粉特异性IgE(sIgE)阳性.1.1.2 试剂及仪器试剂：藜草花粉体内诊断点刺液（德国默克阿罗格）,SephacrylS200HR 葡聚糖凝胶（AmershamPharmaciaBiotechAB）,低分子标准蛋白(上海丽珠东风生物技术有限公司),兔抗人 IgGHRP 及 IgEHRP(丹麦 DAKO 公司).仪器：HDJ8043 核酸蛋白监测仪（江苏兴化市化学分析仪器厂）,POWERPAC200 电泳仪，MiniPROTEANⅡCell 电泳槽(美国 BIORAD 公司).1.2 方法1.2.1 血清标本采集及处理常规静脉取血 3mL,室温下以 2000r/min×15min,离心后将血清移至另一试管中,在-20℃冰箱保存备用.1.2.2 藜草花粉粗浸液的制备［4］用自然脱落法采集当地藜草花粉,过筛除杂质室温下乙醚脱脂.取脱脂花粉 10g 加 Cocas 液 200mL,用超声粉碎机粉碎、提取、减压过滤.提取液以 PBS 液透析 24h,自然蒸发浓缩.1.2.3 藜草花粉变应原的分离称取 SephacrylS200HR 葡聚糖凝胶 10g,用0.04mol/L,pH7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）250mL 溶胀.将糊状的SephacrylS200HR 凝胶一次倾入 1.6cm×60cm 洁净层析柱中使之自然沉降,待凝胶沉积后,用 2~3 倍柱床体积的 PBS 平衡层析柱.将浓缩的花粉粗制液 3mL 离心（10000g/min×10min）后加入凝胶柱里,连接恒流泵,以 30mL/h 的流速用 PBS 洗脱层析柱,并以 6min/tub 分管收集洗脱液.用核酸蛋白监测仪监控洗脱情况,得洗3脱曲线,有 3 个洗脱峰（S200P1,P2,P3）.后两峰为无色液体,蛋白含量少,弃之.将前一峰洗脱液收集,经浓缩、透析、离心（10000g/min×10min）,冰箱冷存备用.1.2.4SDSPAGE 检测各组分蛋白质分子质量区带取标准蛋白、粗制液、洗脱峰（S200P1）各 40μL,进行 SDSPAGE.采用不连续 PAGE,分离凝胶浓度 125mL/L,浓缩胶浓度 50mL/L,电极缓冲液 pH8.3.电泳在室温中进行,电压为 150V,染料迁移至凝胶下端约 1cm 处停止电泳.将凝胶片取出染色 1h,倾出染色液,用蒸馏水洗凝胶数次后加入脱色液,数小时换液一次,直到背景清晰.选用分子质量已知的标准蛋白［5］ （兔磷酸化酶 97.4ku,牛血清白蛋白 66.2ku,兔肌动蛋白 43.0ku,牛碳酸酐酶 31.0ku,胰蛋白酶抑制剂 20.1ku,鸡蛋清溶菌酶 14.4ku）作标记物,与待检样品同一条件下电泳.测量标准蛋白迁移距离,计算迁移率(迁移距离/总距离),以它为横坐标,标准蛋白分子质量的对数为纵坐标,可得到一条标准曲线,根据待测蛋白的迁移距离,从标准线上可求得其分子质量.1.2.5 电泳转印切取与电泳凝胶相同大小的聚乙烯二氟膜(PVDF 膜),用电转移缓冲液润湿,放在电泳后的凝胶上,用润湿的 Whatman3mm 滤纸支持；用另一块润湿的滤纸贴在凝胶的另一面,形成一套夹心的“三明治”.将“三明治“置于两块充分浸润的碳板之间,PVDF 膜朝向阳极,接通恒流电源,电流 20Ma,转印 2h,取出 PVDF 膜夹在两张干燥的滤纸之间干燥.1.2.6 血清免疫印迹检测将 PVDF 膜切成 2mm 宽的条带,置于转移槽中.用 PBS缓冲液冲洗 10min,加入 30mL/L 脱脂奶粉封闭,摇床摇约 1h.再用 PBS 缓冲液洗 3次,每次 5min,然后加入 10 例藜草花粉过敏的患者血清样本,室温下摇动 2h.用PBS 缓冲液洗 3 次后,分别加入兔抗人 IgGHRP、兔抗人 IgEHRP,室温摇动 1h.再用PBS 缓冲液洗 3 次,加入底物溶液反应至抗原区带显色后终止反应,将 PVDF 膜夹在滤纸中干燥,成像后暗处保存.2 结果2.1 藜草花粉变应原经 SDSPAGE 藜草花粉变应原浸液蛋白电泳经考马斯亮蓝染色清晰地显示出 12 条区带,各区带蛋白分子质量依次为92,63.1,61,52,45,43,39.7,38.9,34,31.6,28.4 和 18.5~12ku,其中分子质量在18.5~12ku 的蛋白带宽、色深,含量最丰富(图 1).图 1 藜草花粉变应原浸液 SDSPAGE 分析略2.2 免疫印迹以兔抗人 IgEHRP 为二抗体,10 例患者血清免疫印迹检测均为阳性,可见 4 条反应带,分子质量依次为 92,34,31.6 和 18.5~12ku；分别与70%,50%,80%和 90%的患者血清 sIgE 结合(图 2).以兔抗人 IgGHRP 为二抗体,10例患者血清免疫印迹检测均为阳性,可见 8 条反应带,分子质量依次为92,61,52,45,43,39.7,31.6 和 18.5~12ku；分别与80%,40%,10%,20%,80%,10%,10%和 100%的患者血清特异性 IgG(sIgG)结合(图 2).图 2 免疫印迹分析略43 讨论藜草,一年生藜科草本植物,属风媒花粉,授粉高峰期为 7~9 月,是我国夏秋季节重要的吸入性致敏原.花粉成分中除了含有 250ml/L 的水分外,还含有多糖、脂肪、蛋白质和多肽.这些成分都能致敏,但其中最主要的致敏抗原成分为蛋白质.藜草花粉变应原经 SephacrylS200HR 凝胶层析后通过 SDSPAGE 清晰显示了 12 条电泳区带,蛋白质分子质量为 92~12ku.其中分子质量在 18.5~12ku 的蛋白质区带色深且宽,含量最丰富.可见藜草花粉变应原至少有 12 种蛋白质成份,分子质量为18.5~12ku 的蛋白质占优势.致敏花粉免疫学特性是指花粉的变应原性和免疫原性.变应原性指抗原刺激机体产生特异性 IgE 抗体的能力；而免疫原性是指抗原诱导机体产生 IgG 型抗体的特性［6］.本研究发现藜草花粉变应原中有些成分兼有变应原性和免疫原性.分子质量在 18.5~12ku 的蛋白质可被 90%患者血清 IgE 识别,血清 IgG 的结合率达 100%.虽然 100%的血清 IgG 结合率与样本的大小。