谷物种子蛋白质中赖氨酸含量的测定.docx

谷物种子蛋白质中赖氨酸含量的测定一、 实验目的掌握茚三酮比色法测定氨基酸含量的原理和方法，测定谷物种子蛋白质中赖氨酸 含量二、 实验原理蛋白质中的赖氨酸具有一个游离的£-NH2，它与茚三酮试剂反应生成蓝紫色物 质，其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸的含量成线性关系因此，用已知浓度 的游离氨基酸制作标准曲线，通过比色分析（530nm ）即可测定出样品中的赖 氨酸含量亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同，而且仅有一个游离氨基（£-NH2），所以通常 用亮氨酸配制标准液但由于这两种氨基酸分子质量不同，以亮氨酸为标准计算 赖氨酸含量时，应乘以校正系数1・1515,最后再减去样品中游离氨基酸含量三、 实验仪器1电子分析天平（1/1000）、可见分光光度计、恒温水浴箱、干燥器、移液TO方器2. 试管架（塑及铝）、具塞试管、具塞三角瓶、细口瓶、漏斗（或0.45um滤 膜）、吸管等四、 实验试剂1. 0.4mol/L柠檬酸缓冲液：称取4.202g柠檬酸和5.88g柠檬酸三钠，溶于 100ml蒸馏水中2. 茚三酮试剂：称40mg二氯化锡（防腐）溶于25ml柠檬酸缓冲液中；称lg 茚三酮溶于25ml 95%乙醇中；将上述两液混合摇匀，滤去沉淀，上清液置冰 箱中保存备用。

3. 0.02mol/L盐酸：取12mol/L盐酸0.17ml,用蒸馏水稀释定容至100ml4. 亮氨酸标准液：准确称取20mg亮氨酸，加数滴0.02mol/L盐酸使之溶解, 然后用蒸馏水稀释定容到100ml，则得浓度为200pg / ml的标准液5. 60%乙醇6. 4%碳酸钠：称取4g无水碳酸钠，溶于100 ml蒸馏水7. 2%碳酸钠五、 操作步骤1标准曲线的制作取7支具塞试管，按表进行编号、加入试剂，顺序操作以第1管为空白，在 530nm波长下比色，读取吸光度值并以吸光度值为纵坐标，亮氨酸含量（pg） 为横坐标，绘制标准曲线2. 样品前处理不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过80〜100目筛子，收集过筛后的细粉， 放入广口瓶中，加入沸程60〜90 °C的石油醚，使其淹过粉面，浸泡8小时， 不时摇动进行脱脂然后过滤，并用石油醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液将脱脂 玉米粉凉在干净的滤纸上，置阴凉通风处吹干石油醚收集干粉，置于干燥器内， 保存备用3. 样品的测定取15mg已粉碎脱脂的玉米样品于具塞干燥试管内，加2%碳酸钠1.0ml，于 80C水浴中提取20min，然后加茚三酮试剂2.0ml，继续保温显色30min， 冷却后加60%乙醇3.0ml，混匀后过滤或离心，然后在530nm波长下比色。

六、 实验结果样品中赖氨酸的含量（％）=［从标准曲线上查得值（pg） xi0-y（样品重mg）］x1.1515x100%-C校正系数：1.1515； C：游离的氨基酸含量七、 注意事项1各种作物种子中游离氨基酸含量是:玉米0.01%、小麦0.05%、水稻0.01%、 高粮0.04%2.茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复， 必须严格控制上述条件样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色标准曲线的制作及样品测定参考表试管号试剂1#（空白）2#3#4#5#6#7#（样品）亮氨酸标准液（ml）00.10.20.30.40.5/蒸馏水（ml）0.50.40.30.20.10/亮氨酸含量（卩g）020406080100/4%碳酸钠（ml）0.50.50.50.50.50.5/脱脂样品（mg）//////152%碳酸钠（ml）//////1.0//////80C水浴20分钟茚三酮试剂(ml)2.02.02.02.02.02.02.0混匀，加塞,80°C水浴30分钟，冷却至室温60% 乙醇(ml)3.03.03.03.03.03.03.0//////过滤混匀A530蛋白质中赖氨酸（lysine, Lys）的含量是谷物品质的主要指标之一。

由于动物及人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖 氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义本实验分别用茚三酮溶 液显色法和染料结合法（Dye Binding Lysine, DBL）测玉米种子 中赖氨酸含量一、茚三酮显色法原理：谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的e-NH2, 它与茚三酮（ninhydrin）试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质， 其颜色与赖氨酸残基的数目成正相关选用碳原子数目与赖氨酸相同 的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖 氨酸的含量.二、材料、仪器设备（一） 材料：不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过100目筛子, 收集过筛后的细粉，放入广口瓶内，加入沸程60〜90°C的石油醚， 使其淹过粉面，浸泡8h,不时搅动进行脱脂然后过滤，并用石油 醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液将脱脂玉米粉晾在干净的滤纸上，置 阴凉通风处吹干石油醚收集干粉，置干燥器内，保存备用二） 仪器设备:1. 722型分光光度计；2.水浴锅；3.试管；4.圆 头玻璃棒（圆头大小要与试管大小配套）三） 试剂：1.缓冲溶液，称取30g甲酸钠，溶解于约60ml蒸馏 水中，加入10ml8%的甲酸，最后加水到100ml； 2■茚三酮试剂，称取1g茚三酮和1g氯化镉(CdCl2・H2O),加入25ml上述缓冲溶 液和75ml乙二醇，室温下放置一天，第二天使用。

若出现沉淀，则 过滤后使用该溶液一定要头一天配制，第二天使用，不宜。