神经细胞体外培养方法及应用.ppt

神经细胞体外培养神经细胞体外培养方法及应用方法及应用田东萍田东萍汕大医学院病理教研室汕大医学院病理教研室神经细胞体外培养的历史神经细胞体外培养的历史n神神经经组组织织的的体体外外培培养养方方法法是是由由HarrisonHarrison，，于于19071907年年首首创的n由由于于该该方方法法具具有有简简化化细细胞胞生生化化环环境境、、明明确确生生长长条条件件、、便便于于施施加加实实验验因因素素及及容容易易获获得得活活体体直直接接观观测测结结果果等等优优点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段n九九十十余余年年来来，，这这项项技技术术已已从从组组织织块块（（或或植植块块））培培养养（（ explantexplant cultureculture）） 发发 展展 到到 分分 离离 细细 胞胞 培培 养养( (dissociated dissociated cell cell culture)culture)，，并并逐逐渐渐与与多多种种现现代代技技术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用n 组组织织块块培培养养→分分离离细细胞胞培培养养→甚至单一型细胞培养甚至单一型细胞培养神经组织的植块培养法神经组织的植块培养法n悬滴培养方法悬滴培养方法n单盖玻方法单盖玻方法n双盖玻方法双盖玻方法   1925n改良双盖玻方法改良双盖玻方法n培养物：培养物：         CNS灰质、白质、外周神经节或神经小段灰质、白质、外周神经节或神经小段                 ↓                            ↓               突起突起             非神经元外伸非神经元外伸优点优点n 所需培养液量少，可反应组织代谢中所需培养液量少，可反应组织代谢中       微量生化改变微量生化改变n  保留了植块内组织特征保留了植块内组织特征不足不足n 培养空间小，培养空间小，O2    CO2供少供少n  培养空间湿度难以控制，水分会蒸发培养空间湿度难以控制，水分会蒸发n  密封手续繁杂，不利更换培养液，难密封手续繁杂，不利更换培养液，难       以观察单个神经元生长。

以观察单个神经元生长神经元的分离细胞培养方法神经元的分离细胞培养方法1956年，年，Nakai首创了神经组织的分离培养方法首创了神经组织的分离培养方法材料来源：胚胎动物神经组织材料来源：胚胎动物神经组织n神经元增殖发生于胚胎期神经元增殖发生于胚胎期n形形态态学学分分化化和和化化学学分分化化程程度度低低，，体体外外存存活活强强，，成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤部位：部位：部位：部位：灰质、灰质、PNS神经节，神经元集中，密度大神经节，神经元集中，密度大 神经元的体外培养液神经元的体外培养液n 天然合成成分天然合成成分   血清血清     血浆血浆   胚胎撮液胚胎撮液n  人工培养基人工培养基n  无血清培养基无血清培养基       化学限定性培养基化学限定性培养基n   常用的：常用的：DMEM + 添加剂添加剂                         F12①葡葡萄萄糖糖 为为神神经经元元能能量量代代谢谢主主要要来来源源 3333mmmm②CO②CO2 2 NaHCONaHCO3 3缓缓冲冲系系统统重重要要 HEPESOHEPESO2 2耗耗量量更更高高③③K K+ + 神神经经元元生生理理活活动动的的重重要要离离子子，，K K+ +是是神神经经元元存存活活所所必必需需的的，，K K+ + 24.5mM 24.5mM 能能提提高高神经元存活，促分化神经元存活，促分化④④非神经元成分的抑制非神经元成分的抑制 有有 2-3 2-3天天 神经元无血清限定培养液神经元无血清限定培养液                                 人人工工合合成成的的培培养养基基虽虽然然具具备备了了细细胞胞生生长长的的基基本本营营养养物物质质和和无无机机盐盐类类，，但但仍仍无无法法满满足足不不同同类类型型细细胞胞的的特特殊殊需需要要。

大大多多数数神神经经元元在在基基础础培培养养液液中中即即使使能能够够存存活活也也为为期期不不长长，，更更难难以以分分裂裂因因此此可可根根据据神神经经元元的的特特性性，，给给基基础础培培养养中中再再添添加加某些特殊物质某些特殊物质选择添加剂的基本过程选择添加剂的基本过程n  限定连续细胞系的体外生长条件限定连续细胞系的体外生长条件n 试定该细胞系来源的细胞的培养试定该细胞系来源的细胞的培养 液条件液条件BottensteinBottenstein实验室经过长期研究实验室经过长期研究发现如下添加剂比较好发现如下添加剂比较好      人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺加入到加入到F F1212与与DMEM 1:1DMEM 1:1混液中，可以代替血清混液中，可以代替血清添加物，用来培养大鼠添加物，用来培养大鼠CNSCNS的成神经细胞瘤细的成神经细胞瘤细胞删去其中任何一种添加物都可导致成神经胞删去其中任何一种添加物都可导致成神经细胞瘤细胞生长状况锐减该实验室共列出了细胞瘤细胞生长状况锐减该实验室共列出了三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分别为别为N N1 1、、N N2 2、、N N3 3。

N N1 1的配方为的配方为n 胰岛素胰岛素5μg/mln 转铁蛋白转铁蛋白5μg/mln 孕酮孕酮20 nMn 腐胺腐胺100Umn 硒硒30nM神经体外培养的生长基质神经体外培养的生长基质  n胶胶  元元    n 多聚赖氨酸多聚赖氨酸  n LN神经细胞培养操作程序表神经细胞培养操作程序表 脊髓后根节脊髓后根节                    大脑皮质大脑皮质           孕孕18~20天大鼠胚胎天大鼠胚胎             新生新生1~3天大鼠天大鼠               在在CMF-Hanks液中取出组织除去脑膜液中取出组织除去脑膜                                                                      与与CMF-Hanks 液一起移至离心管液一起移至离心管                                                      舍弃舍弃CMF-Hanks液，再加入液，再加入5ml 0.25%胰蛋白酶和胰蛋白酶和5滴滴0.2%Dnase液液                                                  370C，30min舍弃胰蛋白酶，加入舍弃胰蛋白酶，加入5ml培养液和培养液和10滴滴Dnase液液用巴斯德吸管吹打用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加样器头的加样器吹打次，再用套有微量加样器头的加样器吹打20次次若有组织残渣，将上清移至新试管再加若有组织残渣，将上清移至新试管再加3ml培养液反复吹打培养液反复吹打将细胞悬液收集于离心管，离心将细胞悬液收集于离心管，离心1200r/min ，，8min，，舍去上清，向沉舍去上清，向沉淀加培养液，离心淀加培养液，离心1200r/min，，8min加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为1×101×107 7种入涂有种入涂有poly-D-lysinepoly-D-lysine的盖片上，每片的盖片上，每片5050μlμl放入放入CO2孵箱中过夜孵箱中过夜次日加次日加3ml培养液培养液2 2天后（培养的第三天）换入有天后（培养的第三天）换入有DNADNA合成阴断剂的培养液合成阴断剂的培养液 神经元的分离培养过程神经元的分离培养过程大鼠大脑皮层神经组织细胞培养大鼠大脑皮层神经组织细胞培养组织来源组织来源n新生大鼠新生大鼠1-2日龄，碘日龄，碘 酒酒 ，洒精消毒。

洒精消毒n 断断头头，，取取出出大大脑脑，，分分离离脑脑 膜膜 ，，夹夹取取两两侧侧大大脑脑皮皮质质放放入接种培养液中，用入接种培养液中，用D-Hank’s冲洗二遍冲洗二遍n剪碎，剪碎，0.5-1mm3,用用D-Hank’s充分洗去残血充分洗去残血n加加入入5-10倍倍量量0.25%胰胰蛋蛋白白酶酶，，移移入入离离心心管管中中放放到到水水370C浴箱中消化浴箱中消化20-25分钟n终终止止消消化化离离心心洗洗涤涤  2000转转/分分 ，，5分分钟钟弃弃上上清清吹吹打打制成细胞悬液制成细胞悬液n台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的24孔板中n370C   5%CO2培养培养2天后换生长培养液天后换生长培养液大鼠海马神经细胞培养方法大鼠海马神经细胞培养方法 神经元体外生长特征神经元体外生长特征接种密度与体外存活率接种密度与体外存活率n 当当96孔孔 每每孔孔2000-3000个个 或或 7000-10000个个/cm2几乎无神经元存活几乎无神经元存活 n 当当8000-12000个个/96孔孔  或或 2.8万万-4万万个个/cm2  存存活率最大。

活率最大n3天天后后不不到到接接种种的的一一半半，，故故研研究究某某一一生生长长因因子子前前3天加药最好天加药最好神经元的体外存活时间神经元的体外存活时间n      短短1-2Wn    长长 4个月个月体外分化标志体外分化标志n  破伤风毒素破伤风毒素  n   NSE    n   NF200,NF160神经细胞的特殊染色鉴定方法神经细胞的特殊染色鉴定方法n    尼氏体染色尼氏体染色    焦油紫焦油紫                                    甲苯胺蓝甲苯胺蓝   硫瑾等组化染色硫瑾等组化染色n    镀银染色镀银染色    n    NADPH-d特异性神经组织化学法特异性神经组织化学法神经细胞培养的应用神经细胞培养的应用应用领域应用领域研究各种因素对神经的影响研究各种因素对神经的影响研究各种因素对神经的影响研究各种因素对神经的影响1. 化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子，化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子，    自由基，外伤、高温等因素，病毒感染自由基，外伤、高温等因素，病毒感染2. 药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如    中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子  （（bFGF），），神经营养因子神经营养因子3.  细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。

细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等4.  各种生理病理状态下神经元状态改变各种生理病理状态下神经元状态改变实验方法实验方法研究手段及测量指标研究手段及测量指标1. 形态学观察：形态学观察：    光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触    电镜：超微结构电镜：超微结构2. 激光共聚焦扫描显微镜（激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope, LCSM) ：：研究细胞内成分变化，离子改变研究细胞内成分变化，离子改变等，三维重建等，三维重建3. 膜片钳技术，细胞表面通道和离子流动，电变化膜片钳技术，细胞表面通道和离子流动，电变化研究手段及测量指标研究手段及测量指标4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化聚丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化5. 染色：苏木素染色：苏木素-伊红（伊红（HE））染色及尼氏（染色及尼氏（Nissl)染色，免疫组化染色染色，免疫组化染色6. 显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起长度及胞径长度及胞径7. 荧光光度分析仪：荧光光度分析仪：MTT法测定细胞的法测定细胞的OD值值培养神经细胞的观察和鉴定培养神经细胞的观察和鉴定1. 1. 神经细胞培养存活的标志：种植神经细胞培养存活的标志：种植2424小时后贴小时后贴壁，渐长出几十微米的突起，神经细胞大多都壁，渐长出几十微米的突起，神经细胞大多都能存活。

能存活2. 2. 特殊培养阶段：培养的特殊培养阶段：培养的9 9到到1212天之间，有较多天之间，有较多神经元死亡，以后存活下的细胞突起长而多，神经元死亡，以后存活下的细胞突起长而多，互相形成网络，电镜下可见突触互相形成网络，电镜下可见突触3. 3. 形态学观察：神经细胞胞体大，饱满，核大，形态学观察：神经细胞胞体大，饱满，核大，有立体感，折光性强，周围有一圈光晕，轴突有立体感，折光性强，周围有一圈光晕，轴突细长均匀，直径恒定细长均匀，直径恒定研究范围研究范围n  细胞凋亡细胞凋亡n  细胞生长状态细胞生长状态n  存活率存活率n  膜流动性膜流动性n  基因产物表达基因产物表达n  细胞内酶活性细胞内酶活性n  细胞内离子含量变化细胞内离子含量变化n  细胞表面受体，等等细胞表面受体，等等放映完毕放映完毕请多指教请多指教。