质粒DNA的提取及浓度判定ppt课件.ppt

质粒质粒DNA的提取及浓度检测的提取及浓度检测1.目的与要求2. 经过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学惯用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法2. 相关知识及原理质粒质粒(Plasmid) (Plasmid) ：：独立于染色体外的，能自主复制且稳定独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子是一种环状的双链遗传的遗传因子是一种环状的双链DNADNA分子存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多植物细胞中，在细菌细胞中最多DNA超螺旋构造超螺旋构造细菌质粒细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从群，其大小从1Kb-200Kb，它们复，它们复制时利用宿主细胞复制本身基因组制时利用宿主细胞复制本身基因组DNA的同一组酶系的同一组酶系 •严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严厉控严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严厉控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步所以，制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步所以，往往在一个细胞中只需一份或几份拷贝；往往在一个细胞中只需一份或几份拷贝；•松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，份拷贝，假设用一定的药物处置抑制寄主蛋白质的合成假设用一定的药物处置抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。

如较早的质粒才会使质粒拷贝数增至几千份如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处置即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处置才干到达更高拷贝数才干到达更高拷贝数质粒类型：质粒类型：载体载体(Vector)(Vector)：：用于携带重组用于携带重组DNADNA，并且可以使外源，并且可以使外源DNADNA一同复制一同复制与表达的质粒与表达的质粒( (运载工具运载工具) )具备的条件：具备的条件：易于鉴定；易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；在受体细胞中可以独立复制；易于挑选；易于挑选；易于导入受体细胞易于导入受体细胞1.1.抗性基因〔抗性基因〔Antibiotic resistance Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene, Kanamycine resistance gene)resistance gene)2.2.启始复制子〔启始复制子〔ori, Origin of ori, Origin of replication)replication)；；3.3.多克隆位点多克隆位点(MSC, Multiple cloning (MSC, Multiple cloning site or polylinker)site or polylinker)；；4.4.标志基因标志基因(Marker gene, such as (Marker gene, such as LacZ gene)LacZ gene)。

载体的构造：载体的构造：InsertEcoRIXhoI1.9kbDNA DNA 是具有一定构造的物质，一些特殊的环是具有一定构造的物质，一些特殊的环境会导致境会导致DNADNA的变性，如加热、极端的变性，如加热、极端pHpH值、值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使境又可以使DNADNA复性原理：原理：SDSSDS是一种阴离子外表活性剂，它既能使细是一种阴离子外表活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白量变性，所以菌细胞裂解，又能使一些蛋白量变性，所以SDSSDS处置细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的处置细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒破裂，从而使质粒DNADNA以及基因组以及基因组DNADNA从细胞从细胞中同时释放出来释放出来的中同时释放出来释放出来的DNADNA遇到强碱遇到强碱性〔性〔NaOHNaOH〕环境，就会变性然后，用酸性〕环境，就会变性然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNADNA将迅速复性，而基因组将迅速复性，而基因组DNADNA，由于分子宏，由于分子宏大，难以复性。

离心后，质粒大，难以复性离心后，质粒DNADNA将在上清将在上清中，而基因组中，而基因组DNADNA那么与细胞碎片一同沉淀那么与细胞碎片一同沉淀到离心管的底部经过这种方法即可将质粒到离心管的底部经过这种方法即可将质粒DNADNA从细菌中提取出来从细菌中提取出来细菌裂解的方法： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,普通用于质粒大量提取测定测定DNADNA浓度的方法主要有两种，即利用分浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定光光度计法测定DNADNA的紫外光吸收值；第二的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量另外还有一种用于强度来计算核酸的含量另外还有一种用于粗略检测粗略检测DNADNA浓度的方法是经过凝胶电泳，浓度的方法是经过凝胶电泳，与规范分子量相比较与规范分子量相比较DNADNA浓度的测定：浓度的测定：紫外光吸收法：紫外光吸收法：由于组成核酸的碱基由于组成核酸的碱基(G,A,T,C(G,A,T,C〕在〕在260nm260nm处处具有强吸收峰，所以经过测定具有强吸收峰，所以经过测定260nm260nm的吸收的吸收峰即可对峰即可对DNADNA进展定量。

但有时也会由于所进展定量但有时也会由于所处溶液的处溶液的pHpH值不同而导致吸光系数的不同值不同而导致吸光系数的不同因此，普通在中性因此，普通在中性pHpH值左右的环境中进展值左右的环境中进展测定这种方法常用于测定比较纯的样品这种方法常用于测定比较纯的样品3. 资料与料与试剂资 料料 :含含 有有 质 粒粒 pCMV-Myc-T10的的 大大 肠 杆杆 菌菌DH5αpCMV-Myc是是一一种种哺哺乳乳细胞胞表表达达载体体，，它它含含有有一一个个N端端c-Myc 尾尾，，常常用用于于免免疫疫反反响响的的检测和和蛋蛋白白纯化以及作化以及作为诱饵蛋白蛋白检测酵母双酵母双杂交交结果•Suitable host strains: DH5a, HB101, and other general purpose strains.•Selectable marker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 mg/ml) to E. coli hosts.•E. coli replication origin: pUC•Copy number: ~500 InsertEcoR1Xho11.9kbpCMV-Myc-T104. 步骤质粒DNA的提取 碱裂解法溶液溶液1－－GET缓冲液：缓冲液： 50mmol/L葡萄糖，葡萄糖， 10mmol/L EDTA，， 25mMTris-HCl pH8.0。

溶液溶液2－－0.2mol/L NaOH, 1%SDS溶液溶液3－乙酸钾溶液－乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)：： 60mL的的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，冰醋酸， 28.5mL H2OTE缓冲液或水〔缓冲液或水〔+ 20 g/ml RNase 〕〕: 10mmol/L，，Tris-HCl, 1mmol/L，，EDTA ，， pH8.0, 100%乙醇，乙醇，70％乙醇％乙醇留意：留意： 用移液器操作时，每一步都要格外用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在参与溶液小心，特别是在参与溶液II II 和和IIIIII后，一定不要猛烈振荡，以免后，一定不要猛烈振荡，以免切碎切碎DNA(DNA(包括质粒包括质粒DNADNA和基因组和基因组DNA)DNA)！！！！！！1.培培育育细菌菌：：将将带有有质粒粒的的大大肠杆杆菌菌接接种种到到1.5-3ml含含有有相相应抗抗生生素素的的液液体体培培育育基基，，37℃培育培育12～～16小小时;2.取取液液体体培培育育液液1.5-3ml于于Eppendorf管管中中，，10000r/min离离心心1min，，去去掉掉上上清清液液，，参参与与100l溶液溶液1(GET) ，充分混匀放置，充分混匀放置3-5分分钟;3.参参 与与 200l新新 配配 制制 的的 0.2mol/L NaOH+1％％SDS〔〔变性性液液〕〕，，加加盖盖颠倒倒6-7次次使使之之混混匀匀，，冰上放置冰上放置5min;质粒小量提取的方法〔手工提取〕：质粒小量提取的方法〔手工提取〕：4.参与参与150  l乙酸乙酸钾溶液溶液(溶液溶液II)，加盖后，加盖后颠倒倒6-7次混匀，冰上放置次混匀，冰上放置5min;5.用台式高速离心机，用台式高速离心机，10000r/min离心离心7min，上，上清移入另一干清移入另一干净离心管，并加离心管，并加1ml 100％乙醇混％乙醇混匀，匀，12000r/min离心离心5min，弃去上清液，弃去上清液;6.沉淀用沉淀用0.5ml 70％乙醇清洗一次，％乙醇清洗一次， 12000r/min离心离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，上，除尽乙醇，室温自然枯燥除尽乙醇，室温自然枯燥;7.参与参与30-50l含有含有20g/ml RNase的的灭菌蒸菌蒸馏水水或或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使，使DNA充分溶解充分溶解(有有时需求酚需求酚:氯仿抽提仿抽提);8.将分将分别出的出的质粒粒DNA置于置于-20℃保管保管备用。

用BiodevBiodev〔博大泰克〕质粒快速〔博大泰克〕质粒快速提取试剂盒〔提取试剂盒〔plasmid rapid plasmid rapid isolation kitisolation kit〕〕 碱裂解法；离心柱构造；特殊硅基质吸附资料碱裂解法；离心柱构造；特殊硅基质吸附资料运用前按阐明再溶液运用前按阐明再溶液I中参与中参与RNase；向洗脱液；向洗脱液中按中按1:3的比例参与无水乙醇的比例参与无水乙醇操作步骤操作步骤1.1.搜集搜集1.51.5－－3ml3ml菌液沉淀于菌液沉淀于1.5ml1.5ml离心管中离心管中参与参与100100 l l溶液溶液1 1，振荡至彻底悬浮振荡至彻底悬浮2.2.为了获得高质量的质粒为了获得高质量的质粒DNADNA，培育细菌的时，培育细菌的时间不宜过长，普通为间不宜过长，普通为1212小时；小时；3.3.细菌沉淀中参与溶液细菌沉淀中参与溶液1 1后，一定要彻底悬浮，后，一定要彻底悬浮，否那么抽提质粒否那么抽提质粒DNADNA的纯度及得率会大大降的纯度及得率会大大降低低4.4.参与参与150150 l l溶液溶液2 2，立刻轻柔颠倒离心管数，立刻轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。

随后将离心管冰上放置清亮随后将离心管冰上放置1 1－－2 2分钟〔分钟〔时间勿超〕时间勿超〕3.3.参与参与150150 l l溶液溶液3 3，立刻温暖颠倒离心管数次，，立刻温暖颠倒离心管数次，室温放置室温放置5 5分钟12000rpm12000rpm离心离心1212分钟4.4.要获得更好得质粒提取效果，请于步骤要获得更好得质粒提取效果，请于步骤2 2和步骤和步骤3 3后，冰上放置后，冰上放置5.5.将将420420 l l结合缓冲液参与离心柱中然后将步结合缓冲液参与离心柱中然后将步骤骤3 3的上清参与离心吸附柱中〔尽量去除杂质〕，的上清参与离心吸附柱中〔尽量去除杂质〕，混匀12000rpm12000rpm离心离心3030秒钟倒掉废液搜集管秒钟倒掉废液搜集管中得溶液中得溶液6.6.参与参与750750 l l洗涤缓冲液于离心吸附柱中，洗涤缓冲液于离心吸附柱中，12000rpm12000rpm离心离心1 1分钟•浓缩漂洗液配置成任务浓度时，一定要运用无浓缩漂洗液配置成任务浓度时，一定要运用无水乙醇，否那么，吸附于硅基质资料上的水乙醇，否那么，吸附于硅基质资料上的DNADNA能能够被洗脱下来，影响回收效率。

够被洗脱下来，影响回收效率•A.A.反复步骤反复步骤5 5一次；一次；B.B.随后，再次于随后，再次于12000rpm12000rpm空空管离心管离心2 2分钟，尽量除去漂洗液分钟，尽量除去漂洗液•洗涕时〔即步骤洗涕时〔即步骤5 5和和6 6〕一定要尽量除去漂洗液，〕一定要尽量除去漂洗液，否那么，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶否那么，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶促反响必要时，可适当延伸离心时间或者用促反响必要时，可适当延伸离心时间或者用TipTip头吸净•假设含有较多得蛋白、盐类等杂质，可多洗假设含有较多得蛋白、盐类等杂质，可多洗涤几次•小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管中参与离心管中参与50 l洗脱缓冲液，室温洗脱缓冲液，室温放置放置5分钟后，分钟后，12000rpm离心离心1分钟•洗脱缓冲液一定要参与离心吸附柱中硅基质洗脱缓冲液一定要参与离心吸附柱中硅基质资料得正中，以确保被吸附在硅基质资料中资料得正中，以确保被吸附在硅基质资料中得得DNA都能被洗脱下来为提高回收效率，都能被洗脱下来为提高回收效率，可适当加大洗脱液体积及洗脱次数。

可适当加大洗脱液体积及洗脱次数•为了充分除尽了充分除尽RNARNA的的污染，可在提取的染，可在提取的质粒中粒中参与参与0.50.5lRNaseAlRNaseA〔〔10mg/ml10mg/ml〕这并不影响并不影响其他后其他后续实验，所提取的，所提取的质粒的粒的纯度足以用来度足以用来作作为测序模板和其他序模板和其他酶促反响•假假设提取的提取的质粒大于粒大于10Kb10Kb，在参与洗脱，在参与洗脱缓冲液冲液后，可在后，可在70℃70℃水浴中放置水浴中放置3 3－－5 5分分钟，以确保，以确保质粒粒DNADNA的完全洗脱的完全洗脱B. 用分光光度计法定量用分光光度计法定量DNA取取2 l提提取取的的质质粒粒DNA，，参参与与98 l蒸蒸馏馏水水对对待待测测DNA样样品品做做1:50(或或更更高高倍倍数的稀释数的稀释);蒸蒸 馏馏 水水 作作 为为 空空 白白 ,在在 波波 长长 260nm、、280nm处处调调理理紫紫外外分分光光光光度度计计读读数数至零3.参参与与DNA稀稀释释液液，，测测定定260nm 及及280nm的的吸吸收收值值260nm 读读数数用用于于计计算算样样品品中中核核酸酸的的浓浓度度，，OD260值值为为1相相当当于于约约50 g /ml双双链链DNA，，33 g /ml单单链链。

可可根根据据在在260nm以以 及及 在在 280nm的的 读读 数数 的的 比比 值值 〔〔OD260/OD280〕〕估估计计核核酸酸的的纯纯度度普普通通DNA的的纯纯品品，，其其比比值值为为1.8，，低低于于此此值值阐阐明有蛋白质或其它杂质的污染明有蛋白质或其它杂质的污染4.记录OD值，，经过计算确定算确定DNA浓度或度或纯度，公式如下度，公式如下:5. 6. dsDNA=50×(OD260) × 稀稀释倍倍数数7.以上以上浓度度单位位为g /mlC. C. 凝胶电泳检测凝胶电泳检测DNADNA的浓度的浓度0.8%0.8%的琼脂糖凝胶，的琼脂糖凝胶，100V,40100V,40分钟NEB NEB 规范分子量片段规范分子量片段(1kb DNA Ladder)(1kb DNA Ladder)1 kb DNA Ladder1 kb DNA Ladder虽然不能然不能对DNADNA质量量进展准确定量分展准确定量分析，但可以析，但可以经过与相近的与相近的条条带进展比展比较估算出大估算出大约的数据每条的数据每条带大大约的量的量如下〔按如下〔按0.5μg0.5μg上上样量量计。

应按按1313条条带计算，由于算，由于3kb3kb的量是其它片段量的近三的量是其它片段量的近三倍〕：倍〕： 片段碱基对质量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*0.5kb 的条带由的条带由500bp和和517bp组组成，这样即使在低分子量区域条成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一带的强度也比较均一 5. 实验报告实验报告目的与要求目的与要求实验原理实验原理资料与方法资料与方法结果与讨论结果与讨论。