高中生物 专题五 dna和蛋白质技术课件 新人教版选修1.ppt

专题5 DNA和蛋白质技术,考纲要求： 1、蛋白质的提取和分离 2、PCR技术的基本操作和应用,课题1 DNA的粗提取与鉴定,（一）提取DNA的方法,DNA提取的原理,一、基础知识,DNA在NaCL溶液中的溶解度曲线,（1）DNA在不同浓度NaCL中的溶 解度不同，0.14mol/L最小， 2mol/L的NaCl溶解DNA加水 稀释降至0.14mol／L时析出⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,某些蛋白质溶于酒精，DNA析出,蛋白酶：,高 温：,洗涤剂：,⑵ DNA不溶于酒精溶液,水解蛋白质,多数蛋白质不能忍受60～80℃，DNA在80℃以上才会变性,瓦解细胞膜，对DNA无影响二）DNA鉴定的原理,沸水浴条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色,二、实验设计,（一）实验材料的选取,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,选取DNA含量较高的生物材料,注意安全，环境保护，不用珍稀濒危生物,动物细胞,蒸馏水,植物细胞,洗涤剂 食盐,所用溶液,目的,细胞吸水胀破,溶解细胞膜,溶解DNA,（都要搅拌）,提取的DNA少，看不到丝状物，鉴定无蓝色,植物材料研磨不充分，结果会怎样？,滤液中可能含有哪些成分？,核蛋白、多糖和RNA等杂质,（三）除去滤液中的杂质,１、方案一为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除 杂质？,高盐溶液溶解DNA,除高盐不溶的杂质,除溶于低盐的杂质,低盐溶液析出DNA,２、方案二与方案三的原理有什么不同？,方案三：用DNA和蛋白质对高温耐受性不同， 蛋白质变性，与DNA分离。

四）DNA的析出与鉴定,析出,加与滤液等体积的冷酒精(体积分数95％)，静置2－3min，出现白色丝状物用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，用滤纸吸干水分将处理后的溶液过滤,方案二：蛋白酶分解杂质蛋白,鉴定,二苯胺、沸水浴、设置对照,2、加入洗涤剂后，动作轻缓、 柔和，否则产生大量的泡 沫加入酒精和玻璃棒搅 拌时，动作轻缓，以免加 剧DNA分子的断裂三、操作提示,1、以血液为实验材料时，加 柠檬酸钠，防止血液凝固3、二苯胺试剂要现配现用四、结果分析与评价,2、如果不呈现蓝色，或实验结果不明显，可能的 原因有哪些？,1、观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物， 说明什么？,杂质较多,核物质没充分释放，如研磨不充分或蒸馏水少,多次搅拌，目的、操作方法不同，要注意区分,二苯胺现配现用,加入酒精时摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏；,蛋白质难度大因易失活；空间结构、理化性质不同，无统一方法3、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取,DNA一样容易吗？,课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片断,体外迅速扩增DNA片段的技术,1、什么是多聚酶链式反应（PCR）？,2、PCR技术有何意义？,3、PCR技术有哪些应用？,解决样品中DNA含量太低而难以分析研究的问题,遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆、DNA序列测定等。

课题背景,一、基础知识,（一）PCR原理,模板,原料,酶,能量,DNA两条单链,四种脱氧核苷酸,解旋酶 DNA聚合酶,ATP,一小段DNA或RNA,提供复制模板,合成子链的原料,打开DNA双螺旋 催化合成DNA子链,为解旋和合成子链供能,使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸,1、DNA分子复制需要哪些基本条件？有何作用？,引物,2、DNA复制为什么需要引物？,DNA聚合酶不能够从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链5’端：,3’端：,5’端,3’端,反向平行,DNA的羟基（—OH）末端,磷酸基团的末端,,,当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从 开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从 向 延伸引物的3′端,子链的5′端,3′端,,,引物,母链的3′端,缓慢冷却复性（55 ℃）,加热变性（80～100℃）,3、双链的解开是DNA复制的前提，在体外如何打开DNA 的双螺旋结构?,利用DNA的热变性原理，通过控制温度来实现PCR仪,4、PCR技术中如何解决高温使酶失活的问题？,用耐高温的TaqDNA聚合酶。

5、PCR反应需要哪些条件？,缓冲溶液、DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的TaqDNA聚合酶，通过控制温度使DNA复制在体外反复进行PCR仪实质上是一台能够自动调控温度的仪器）,（二）PCR的反应过程,1、PCR的每次循环可以分为哪几步？,变性：95℃DNA解旋,复性：温度下降到55℃，引物与DNA单链结合,延伸：72℃左右，合成DNA子链,,,变性95℃,,复性55℃,,延伸72℃,,2、预变性有什么作用？,进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率一般要经历三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物作为模板参与反应，且引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增二、实验操作：,用3个恒温水浴锅，温度分别为94℃、55℃和72℃，按要求，在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管即可1、微量离心管,薄壁塑料管,2、微量移液器,3、如果没有PCR仪，如何怎样来控制温度？,（反应场所）,添加药品的工具,三、操作提示：,1、避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等 高压灭菌。

2、缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存使用 前，取出放在冰块上缓慢融化3、每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头 所有的成分都加入后，盖严离心管的盖子，用手 指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀混匀 后离心处理，使反应液集中在离心管底部一）理论上DNA扩增数目的计算,四、结果分析与评价：,2 n,a x 2 n,（二）实验中DNA含量的测定,1、原理：,DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果1、一条DNA，复制n次， DNA为：,2、a条DNA，复制n次， DNA为：,2、过程,①稀释：,PCR反应液稀释50倍,②对照调零：,蒸馏水作空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值,③测定：,④计算,DNA含量（μg /ml ）＝50 x (260nm的读数）x 稀释倍数,50：在标准厚度为1cm的比色杯中，OD260为1相当于50μg /ml的双链DNA.,,多聚酶链式反应扩增DNA片段,PCR原理,DNA的复制需要酶、原料、引物、模板 DNA的变性、复性和延伸受温度影响,,,PCR过程,变性,复性,延伸,,,,,操作步骤,配制PCR反应体系,移入离心管,放入PCR仪,设置循环程序,DNA扩增,,,,,,测定含量,,稀释,调零,测定并读数,计算,,,,,根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。

引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验,练习：如果要使用PCR扩增一段已知DNA序列，你打算 如何设计引物？,课题3 血红蛋白的提取和分离,根据分子形状、大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质一、基础知识,（一）凝胶色谱法,2、凝胶：,大多数是由多糖（如葡聚糖或琼脂糖）构成的微小的多孔球体，内部有许多贯穿的通道也称分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质1、概念：,3、原理：,相对分子量较小的蛋白质易进入凝胶内部的通道，路程长，移动速度慢；,相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在外移动，路程短，移动速度快4、凝胶色谱法分离蛋白质的原理,,,,,,,,,,,,,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,1、概念：,一定范围内，能抵制外界酸或碱对溶液PH的影响，维持PH值基本不变的混合溶液2、缓冲溶液的配制：,1－2 种缓冲剂溶于水中配制,模拟生物体内的过程，保持体外溶液的PH与体内PH基本一致，防止蛋白质失去活性3、意义：,1、概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程,（三）电泳,（二）缓冲溶液,2、原理,③电泳利用待分离样品中各种分子带电性质的差异以及 分子大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速 度，从而实现样品中各种分子的分离。

3、常用方法：,聚丙烯酰胺凝胶电泳；琼脂糖凝胶电泳①许多生物大分子，如多肽、核酸等有可解离的基团， 在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 相反的电极移动红细胞：,血小板,,血浆：,水分、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖,,白细胞,血红蛋白（90％）,血细胞,2、血液,1、用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因？,哺乳动物成熟红细胞无核无器，血红蛋白含量丰富,二、实验操作,四个亚铁血红素基团,特点：,每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白有血红素呈红色两条α－肽链、,两条β一肽链,组成：,3、血红蛋白由哪些成分组成？有什么特点？,样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定,5、蛋白质的提取和分离包括哪几步？,4、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？ 这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？,红细胞中的血红蛋白是有色蛋白，分离时可观察颜色判断什么时候收集洗脱液使分离过程非常直观，简化了实验操作一）样品处理及粗分离,红细胞的洗涤,目的：,去除杂蛋白,过程：,结果：,上清液中无黄色，表明洗涤干净,血红蛋白的释放：,加蒸馏水、甲苯 ，磁力搅拌器搅拌,血样离心、,生理盐水洗涤红细胞、,离心、,重复洗涤三次,,思考,分离血红蛋白溶液：,离心管内离心,透析,过程：,原理：,血红蛋白溶液装入透析袋，透析袋放入磷酸缓冲液透析,目的：,除去样品中分子小的杂质,透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。

粗分离）,吸出血浆、,,,,,思考,（二）凝胶色谱操作（纯化）：,2、凝胶色谱柱的装填,装填完毕，立即连接缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用磷酸缓冲液充分洗涤平衡12小时使凝胶装填紧密1、凝胶色谱柱的制作：,取凝胶浸泡于蒸馏水或缓冲液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液填入色谱柱内,3、样品加入与洗脱,待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集,⑤收集：,④洗脱：,①调节缓冲液面,与凝胶面平齐,②滴加透析样品,③样品渗入凝胶床,加磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，洗脱2、如何检测血红蛋白的分离是否成功？,红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出,血红蛋白处在稳定的pH内，维持结构和功能1、在整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是？,思考：,3、你能描绘血红蛋白分离的完整过程吗？,（1）样品处理：,（4）纯度鉴定：,（3）纯化：,（2）粗分离：,聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定凝胶色谱法除去分子量较大的杂质蛋白,透析除去分子量较小的杂质包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；离心；透析,如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因3、血液样品离心后如果分层不明显，可能的原因是什么？,1、加入什么可以防止血液凝固？,加入柠檬酸钠,思考：,4、如果离心速度过高和时间过长，会有什么影响？,如果离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

2、可以用蒸馏水代替生理盐水吗？,不可以用蒸馏水使细胞提前吸水涨破，使血红蛋白和杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度1、加甲苯的目的是什么？,思考：,细胞膜的磷脂易溶于甲苯，甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白无色透明——有机溶剂（甲苯层）,,,暗红色——红细胞破碎物沉淀,,红色透明液体——血红蛋白的水溶液层,白色薄层固体——脂溶性物质的沉淀层,,,,,用滤纸过滤，。