组合策略提高普鲁兰酶在枯草芽胞杆菌中的表达.docx

组合策略提高普鲁兰酶在枯草芽胞杆菌中的表达普鲁兰酶(EC 3. 2.1. 41)属于a -淀粉酶家族，是一种常在工业上使用的淀粉酶，它可以特异性的水解支链淀粉、糊精、普鲁兰糖等的 a-1,6糖昔键［1］,以到达脱支的作用依据普鲁兰酶水解糖昔键原 理的不同和生成产物的差异，其主要分为I型普鲁兰酶和II型普 鲁兰酶［2］I型普鲁兰酶负责水解a-1,6糖昔键，产物是麦芽三糖和一些线性寡糖；II型普鲁兰酶，是一种双功能酶，它不仅可以水解 a-1,6糖昔键，还能够随机水解淀粉直链上的a-1,4糖昔键，生成还原性末端［3］因此在糖化过程中，普鲁兰酶常与其他淀粉酶如糖化 酶、a-淀粉酶、B-淀粉酶或环糊精葡萄糖基转移酶复配来快速分解 淀粉此外，普鲁兰酶也被广泛应用于生产果葡糖浆、抗性淀粉、乙 醇燃料、啤酒等其他领域［4］尽管已有多种生产普鲁兰酶的微生物被发现，但野生型菌的普鲁兰酶产量偏低，难以实现大规模的工业生产随着基因工程和酶工程 的迅速开展，普鲁兰酶最近在多种模式菌株中实现了异源表达，包括 大肠杆菌［5］、枯草芽胞杆菌［6］、地衣芽胞杆菌［7］、短小芽胞杆菌2. 2.1发酵培养基的单因素优化不同种类的培养基对重组菌的生长与产酶影响较大。

本研究首先 使用单因素优化，来确定培养基的最正确组分，发酵结果如图5所示图5培养基组分对普鲁兰酶表达的影响Fig. 5 Effect of medium components on the expression of pullulanase氮源是微生物生长所必须的基础物质［21］本研究使用了 2种无 机氮源（尿素和硫酸铁）、3种有机氮源（胰蛋白陈、玉米浆、酵母膏） 来考察对于普鲁兰酶生产的影响如图5所示，以玉米浆为氮源时酶 活力最高为66.3 U/mL,其余依此为胰蛋白陈、蛋白陈、酵母膏、硫 酸铁、尿素总体而言，有机氮源更有利于酶的表达碳源是是蛋白 中心骨架构成的重要元素［22］如图5所示，以葡萄糖为碳源时酶活 力最高，为61.2 U/mL0金属离子可以改变细胞膜通透性以促进蛋白 分泌［23］本研究选择了 5种金属离子考察对产酶的影响尽管添加 Ca2+时可提高18%的酶活力，但Zn2+、A13+添加后却导致酶活力大幅 下降，说明金属离子并不一定利于普鲁兰酶胞外表达，跟金属离子价 位也无明显关系此外，不同培养基可使酶活力差异到达1.7倍，进一 步了证明发酵条件对酶表达的重要性然而，将各单因素最正确条件直 接组合，会陷入局部最优的情况，而非全局最正确的情况。

2. 2.2发酵培养基的响应面优化根据单因素试验结果，以响应面设计原理,对每个组分质量浓度 进行优化并设计了 4因素3水平BBD实验，因素编码情况见表3,通 过Design Expert V8. 06设计实验及分析结果（表4）,模型评价结果 见表5所示表3因素水平编码表Coding table of factors and levels表4 Box-Behnken设计方案及结果Design and results of Box-Behnken表5回归模型方差分析表Variance analysis of experimental results 根据BBD实验设计，建立了酶活力与培养基组分间的回归方程:酶活力=15. 70+1. 52A+1. 71B-2. 61C+101. 80D+0. 08AB+0. 31AC-1. 70AD-0. 30BC-0. 59BD+1. 29CD-0. 18A2-0. 03B2+1. 04C2-39. 40D2由模型显著性检验说明，P值和失拟项分别为0.001 3（显著）和0.294 8（不显著）， 说明拟合程度较好此外，模型R2为0. 85,说明能解释约85%总变异, 可信度较好。

基于此，软件预测培养基的最正确组分为玉米浆14.8g/L, 蛋白脓7.3 g/L,葡萄糖17.5 g/L,Ca2+1.2 mmol/Lo在此条件下，发 酵36 h后酶活力到达129. 4 U/mL,相比培养基优化前提高了 4. 4倍 与单因素优化相比，基于模型拟合的响应面优化效果更为明显；与全 因子组合实验（43）相比，实验方案仅有29组，显著减少了实验工作量2. 2. 3发酵培养基的5 L罐培养在5 L罐上进行放大培养,发酵过程如图6所示接种8 h内， 残糖降低17%为14. 1 g/L,0D600到达12（为最大值的26%）说明此 时为细胞生长前期，对营养物质需求较少此后,0D600迅速增加，残 糖几乎与0D600完全呈相反态势，快速降低在24 h左右,0D600首 次超过最大值的80%,此后细胞生长明显放缓恰好此时残糖也首次 降低至补料时间点（溶氧开始反弹，残糖为4. 65,5）由于B. subtilis 在营养贫瘠时会形成芽胞以抵御不良情况，并且芽胞形成是不可逆， 对于工业生产不利并且芽胞也是食品保存的一大障碍和平安隐患 ［24］ o可以通过补加葡萄糖来抑制芽胞的形成，但是过量的葡萄糖会 导致葡萄糖效应，限制菌体生长和酶蛋白的合成［24］。

因此本实验保 持葡萄糖质量浓度在10 g/L左右以平衡两者关系如图5所示，在补 料后，酶活力跟细胞生长出现了 2次上升的态势最终在发酵53 h后， 酶活力到达最高，为226. 4 U/mLo根据发酵过程曲线可知，酶活力与 0D600曲线紧密偶联，符合P566组成型启动子的特征［16］（图6、图 7）o但是酶合成和细胞生长同步，在一定程度上带来细胞代谢压力,影响细胞最终的产酶能力[25] o为进一步提高产酶水平，将对重组菌的发酵进行过程控制，包括分批、分阶段的温度和补料控制策略等图6重组普鲁兰酶在5 L发酵罐的发弊过程曲线The fermentation process curve of pullulanase in 5L fermenter图7重组普鲁兰酶在5 L罐的SDS-PAGE电泳分析图Fig. 6 SDS-PAGE analysis of the recombinant pullulanase in5 L fermenter3结论 本文成功将来源于Baci 1 lusderamificans的普鲁兰酶基因在B. subtilis中异源表达通过强启动子替换、培养基组成的单因素 和响应面优化策略，使酶活力提高至优化前的4.4倍。

最后在5 L罐 进行放大培养，通过葡萄糖补料控制，在发酵53 h后到达最高酶活力, 是初始优化前的7. 7倍以上说明通过优化基因的内在调控元件和外 在发酵环境，可以显著增强B. subtilis目的蛋白的表达，为应用枯草 芽胞杆菌生产其他异源蛋白提供了方法学参考［8］、毕赤酵母等［9］但大肠杆菌和短小芽胞杆菌不是平安菌株，毕 赤酵母的诱导表达需要甲醇的添加，会导致食品平安问题，且毕赤酵 母的发酵时间较长根据GB 2760-2022《食品平安国家标准 食品 添加剂使用标准》规定，食品级普鲁兰酶生产菌株仅为产气克雷伯氏 菌(Klebsiellaaerogenes)、枯草芽胞杆菌(BaciHussubtilis)、嗜酸普鲁兰芽胞杆菌(Bacillusacidopullulyticus) ＞地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformi) 和长野 解普鲁兰杆菌 (Pullulanibacillusnaganoensis)总体来看，提高普鲁兰酶在 B. subtilis中的表达对于满足普鲁兰酶工业应用需求具有非常重要 的意义B. subtilis是革兰氏阳性菌种的模式菌株，其作为表达宿主 被广泛使用，具有以下诸多优点：(1)属于公认的食品级平安菌株 (GRAS认证)［10］； (2)无明显的密码子偏好性，表达异源蛋白时具有 天然优势［11］; (3)分泌能力强，其具有Sec、Tat等4条蛋白分泌途 径以及大量鉴定的信号肽，可以有效地分泌蛋白至胞外以及简化后续 纯化过程［12］； (4)生长速率快，培养、发酵周期短［11］; (5)具有透 彻的研究背景和丰富的基因改造工具［13］。

本研究中，将融合信号肽AprE［14］的Bacillusderamificans普鲁兰酶基因在B. subtilisWB600中表达先后通过启动子类型优化、 培养基组分单因素和响应面优化，提高了普鲁兰酶的表达水平，并在5L罐上进行放大培养1材料与方法 1. 1材料与试剂 1. 1. 1菌株与质粒菌株 B. subtilisWB600-E. coliJM109 为实验室保藏；质粒 pP43NMK由实验室保存；质粒pUC57-Pul由上海生工公司合成，其含有B. subtilis 内源信号肽 AprE 和来源于 Baci 1 lusderamificans 的普鲁兰酶基因(GenBank：KT897705. 1),并根据B. subtilis密码子偏好 性进行优化1. 1.2引物本文中的引物如表1所示表1本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study1. 1. 3试剂Prime STARDNA 聚合酶、Prime STARDNA 聚合酶、DNA Ligation Kit 试剂盒、DNA 连接酶(solution I)、琼脂糖,TaKaRa公司(大连)；柱回收试剂盒、胶回 收试剂盒,Invitrogen；质粒提取试剂盒、氨苇青霉素、卡娜霉素、 即用型无缝克隆试剂盒、尿素、硫酸锭、胰蛋白脓、甘油、葡萄糖、 果糖、蔗糖、麦芽糖，生工生物工程(上海)股份；蛋白陈、酵母粉,OXIOD公司；玉米浆，上海源叶生物科技；SDS-PAGE蛋白电泳试剂盒和标准蛋白，Invitrogen；其他试剂均为国产分析纯。

1. 1. 4培养基LB培养基(g/L)：酵母粉5,蛋白脓10,氯化钠10固体培养基在此基础上添加2%琼脂粉TB发酵培养基(g/L)：甘油5,蛋白蛛12,酵母粉24,磷酸二氢钾31,磷酸氢二钾16. 37o5 L罐补料培养基(g/L)：葡萄糖500,玉米浆65,酵母浸膏35,CaC120. 13o1.2实验方法普鲁兰酶基因的合成与表达载体的构建 利用引物Pul-F/R PCR扩增普鲁兰酶基因，引物Pul-F/R-plasmid扩增pP43 NMK质粒骨架,通过无缝克隆试剂盒，将 片段融合构建质粒P43-Pul质粒的提取参考试剂盒说明书1.2.1 普鲁兰酶重组质粒的转化与鉴定 将重组质粒转化至E. colil09感受态细胞中，在含质量浓度100Ug/mL氨苇西林的LB固定培养基中培养以Pul-F和Clone-R为弓 物，对转化子进行菌落PCR验证阳性转化子进行基因测序确认L2.3B. subtilis转化、培养与表达将测序正确后的质粒转化到B. subtilis,并在LB固定培养基中 培养将单菌落接种到含有20 mL LB培养基的250 mL摇瓶中，37 ℃. 220 r/min培养8 h活化种子液。

接着取1 mL种子液转接至装有25 mL TB培养基的250 mL摇瓶内，37 ℃下发酵，定时测量细胞0D600值和 普鲁兰酶酶活力以上培养基添加卡纳霉素(50 u g/mL) o启动子表达变体的构建根据文献报道，选用强组成型启动子(PlytR,P223,P556和P566 和P6366) [15-17],诱导型启动子(PxylA)[18]、自诱导型启动子 (PsrfA)15]分别替换原有组成型启动子P43(启动子序列见表2) 0 P223、P566和P6366均为短启动子，将其直接设计在引物的非同源部 分所用引物对为 223-F/223-R. 566-F/566-R、6 366-F/6 366-R,PCR 产物通过DNA Ligation Kit连接试剂盒，环化后构建启动子变体剩 余启动。