应用激光显微切割技术研究大鼠短期致肝脏癌前病变机理.doc

Apply Laser Microdissection Method to Study the Mechanism of Short-term Liver Preneoplastic Lesions in RatsRen jin*, Qi xinming, Liu linlin, Wu xiongfei(Center for Drug Safety Evaluation and Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences)ABSTRACT OBJECTIVE: To study the mechanism of liver preneoplastic lesions and the protective effects of resveratrol in short-term liver preneoplastic lesions model in rats with laser microdissection method. METHODS: Male SD rats were treated with diethylnitrosoamine (DEN) and 2-acetylaminofluorene (2-AAF) to induce liver preneoplastic lesions. The placental-type glutathione S-transferase (GST-P) positive altered hepatic foci (AHF) were evaluated as the preneoplastic marker. Oxidative stress, connexin 32 and CYP450 (especially CYP2E1) were also assessed by laser microdissection, immunohistochemical and western blot analysis. RESULTS: 1. The number and area of AHF remarkably increased in the model group (DEN + 2-AAF) and the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) also strongly expressed. Taken together, we can say that this model had been effectively built. 2. Reduced glutathione (GSH) was markedly reduced in model group, which indicated the presence of oxidative stress. 3. We used laser confocal microscope to find that the expression of connexin 32 significantly decreased in hepatocytes around central veins. 4. The enzyme activity and protein expression of CYP1A1 and CYP2E1 were up-regulated, while the expression of CYP1A2 was down-regulated. We used the laser microdissection instrument to collect the AHF. The expression of GST-P and CYP2E1 was much higher in AHF than the hepatocytes around the AHF. A specific inhibitor of CYP2E1, diallylsulfide (DAS), reduced the expression of CYP2E1, meanwhile, the number and area of AHF also decreased. 5. Resveratrol had a similar effect with DAS, which also reduced the expression of GST-P and CYP2E1 in AHF and the hepatocytes around the AHF. The number and area of AHF were also decreased. CONCLUSION: In general, oxidative stress, Cx32 may be involved in the process of preneoplastic lesions. And CYP450 particularly CYP2E1 has a major role in the preneoplastic lesions. Resveratrol has a significant protection on the preneoplastic lesions, which may attribute to CYP2E1.Key words: Short-term Liver Preneoplastic Lesions in Rats, Laser microdissection, CYP2E1, Resveratrol应用激光显微切割技术研究大鼠短期致肝脏癌前病变机理任进* 戚新明 刘琳琳 邬雄飞（药物安全评价研究中心，上海药物研究所，中国科学院，201203）摘要: 目的 建立大鼠短期致肝脏癌前病变模型，采用激光显微切割技术，探讨癌前病变机理和中药白藜芦醇可能的肝细胞保护作用。

方法 以大鼠肝脏为靶器官，用已知的致肝癌化合物二乙基亚硝胺（DEN）为诱变剂，以胎盘型谷胱甘肽巯基转移酶（GST-P）标记的转化灶作为肝细胞癌前病变的终点标记，建立短期致肝脏癌前病变模型同时检测氧化损伤、细胞间隙连接蛋白（Cx32）、CYP450酶等在肝脏细胞癌前病变中的作用进一步应用激光显微切割技术检测CYP2E1在肝脏细胞癌前病变中的作用结果 1. 大鼠短期肝脏癌前病变模型的建立 模型组GST-P阳性转化灶数量增多、面积增大，细胞增生指标PCNA阳性细胞数量显著增加，表明模型建立成功2. 氧化损伤检测 模型组肝脏组织的还原型谷胱甘肽（GSH）明显消耗3. 细胞间隙连接蛋白（Cx32）的改变 激光共聚焦显微镜观察可见，模型组Cx32蛋白在中央静脉周围肝细胞的阳性染色在面积与数量上都有明显降低 4. CYP450酶在癌前病变中的作用 模型组CYP2E1和CYP1A1的活性增加，CYP1A1和CYP2E1蛋白表达均上调；CYP1A2则表达下调进一步用激光显微切割技术，结合连续切片的免疫组化方法，结果表明：转化灶内肝细胞GST-P与CYP2E1的蛋白表达明显高于灶外正常肝细胞而CYP2E1特异性抑制剂大蒜素（DAS）抑制CYP2E1的表达，同时减少GST-P转化灶的数量和面积。

5. 白藜芦醇的肝细胞保护作用 白藜芦醇与DAS作用相似，可以显著的降低灶内、外肝细胞GST-P, CYP2E1的表达，并使转化灶的面积与数目显著减少结论 综上所述，大鼠短期致肝脏癌前病变模型中，氧化损伤、细胞间连接蛋白可能参与了早期损伤过程；肝脏细胞早期损伤可能与CYP450代谢酶尤其是CYP2E1的改变密切相关白藜芦醇有明显的肝细胞保护作用，CYP2E1可能在其中起重要作用关键词：大鼠短期肝脏癌前病变模型 激光显微切割 CYP2E1 白藜芦醇目前国际上常用的检测药物致癌性的实验方法主要是大鼠两年长期致癌实验该实验的结果可靠，但费时费人工而体外试验的假阳性和假阴性率较高，难以准确预测药物的致癌性[1]因此建立并应用快速、可靠的试验替代模型，结合两年长期致癌试验，是国际上公认的检测化学物质致癌性的有效途径短期大鼠致肝癌模型是日本学者伊藤等于1989年建立的，用于检测化合物的致肝癌性该模型自建立以来检测了三百多种化合物，其中，在肝脏致癌物的检测中，有97%的致突变物和88%的非致突变物呈现阳性结果，非肝脏致癌物中，该模型检测的阳性率为21％说明该模型是比较特异的检测肝脏致癌物的试验模型[1][2]。

应用这一模型也可用于早期致癌机理的研究[2][3]，而应用先进的激光显微切割技术，将病变细胞和正常细胞分别切割下来，比较分析RNA、蛋白等的表达差异，可提供最直接的基因、蛋白水平的变化依据，目前广泛认为，这一新技术是将形态学和分子生物学最好的结合方法但多受昂贵的仪器设备和高难度技术的限制，因而开展的不多众所周知，绝大多数药物和致癌物通过肝脏进行生物转化，特别是经CYP酶系代谢后可能活化形成毒性较强的产物，对肝脏产生损害另外，CYP酶代谢后的产物参与基因表达的调控，也参与外源或内源性致癌物前体的生物激活有报道CYP基因族（即CYP1,CYP2,CYP3，CYP4），承担大量的肝脏内外源性物质的代谢作用，与化学致癌物关系比较密切[4] [5]，但是目前关于CYP450参与肝脏癌前病变的研究并不多，研究较多的是CYP2E1在肝脏癌变过程中起到重要的作用[6]在前人研究的基础上，我们采用激光显微切割和连续切片的免疫组化技术研究了CYP450酶尤其是CYP2E1在肝脏癌前病变中的作用白藜芦醇(Resveratrol, Rev) 化学名称为3, 5, 4三羟基苯二烯，是一种广泛存在于葡萄、虎杖、花生等植物性食物或药物中的多酚类活性单体。

近年来大量的体内、体外抗癌试验结果表明，Rev 对多种肿瘤，如肝癌、乳腺癌、皮肤癌、结肠癌等均具有潜在的保护作用大蒜素（Diallylsulfide, DAS）是多种烯丙基有机硫化物复合物，已证明它是CYP2E1的抑制剂[7]有文献报道DAS可以明显的改善DEN引起的肝细胞癌前病变[8]，在实验中作为阳性对照本试验首次应用激光显微切割技术，结合连续切片的免疫组化和Western Blotting两种分析方法，观察大鼠短期致肝脏癌前病变模型中，肝脏转化灶内肝细胞和灶外肝细胞GST-P和CYP450蛋白水平的差异，进一步分析和比较了给予Rev后肝细胞转化灶内、外GST-P和CYP2E1蛋白表达不同，表明Rev具有明显的肝细胞保护作用, 而CYP2E1可能在其中起到重要作用1 材料与试剂1.1实验动物：实验用60只SD大鼠购买于西普尔－必凯实验动物有限公司，饲养在中国科学院上海药物研究所的SFP级动物房1.2主要试剂：二乙基亚硝胺（DEN）、2-乙酰氨基芴（2-AAF）、大蒜素（DAS），p-nitrophenol , ethoxyresorufin, erythromycin购于Sigma。

白藜芦醇购买于陕西慧科植物发展有限公司，兔抗GST-P 抗体购于MBL公司，兔抗CYP2E1、CYP2B1/2、CYP1A1、CYP1A2抗体购买于Chemicon公司，鼠抗PCNA、Connexin 32单抗购于Santa Cruz公司，免疫组化ABC试剂盒购买于中衫金桥公司，HRP标记的GAPDH抗体购买于Santa Cruz公司，ECL试剂盒购买于Amersham公司，谷胱甘肽含量测试盒购自南京建成生物工程公司，其他试剂均为上海国药集团生产的分析纯试剂2 实验方法2.1大鼠短期肝脏癌前病变模型的建立以大鼠肝组织为靶器官，。