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    结核分枝杆菌实验室快速诊断技术进展    (宜州市疾病预防控制中心广西宜州546300)【摘要】结核病是由结核分枝杆菌引起的传染病它已成为严重危害人民身体健康、发病率及病死率很高的传染病建立快速、准确、敏感、特异以及简便的诊断方法是全球控制结核蔓延的关键笔者就近年来结核分枝杆菌实验室快速诊断技术作一综述关键词】结核分枝杆菌；结核病；快速诊断技术结核病是由结核分枝杆菌感染的一种重要的传染病，是世界范围内发病率和致死率都较高的疾病之一，每年新增900万患者，其中300万死亡[1]，而中国结核病发病人数居世界第二位，是22个结核病高负担国家之一[2]结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，长期以来，结核分枝杆菌的实验室诊断主要依赖细菌学涂片和培养检查由于方法所限，严重影响了结核病的及时诊断，因此建立检测快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法，对于结核病防治工作具有重要意义[3]现将近年来结核分枝杆菌实验室快速诊断技术作一综述１结核分枝杆菌快速培养技术1.1噬菌体生物扩增法该方法的基本原理是分枝杆菌噬菌体能感染活的分枝杆菌，未进入感染菌体内的噬菌体被随后加入的杀毒剂灭活，已进入菌体内的噬菌体不受影响，噬菌体在感染菌体内大量增殖，并将菌体裂解，释放出的子代噬菌体可感染随后加入的指示细胞，并将其裂解，在琼脂平板上出现透亮的噬菌斑，因此，只要根据噬菌斑的有无即可判断待检标本中是否存在活的结核分枝杆菌[4]。

近年来分枝杆菌噬菌体在结核病快速诊断的研究报道很多，文献[5-6]的应用研究显示，噬菌体生物扩增法检测结核病标本的阳性率高于涂片和罗氏培养，且操作简便、快速、灵敏度高、特异性强，可作为临床结核分枝杆菌的快速检测方法2全自动培养系统全自动培养系统已进入临床应用，如BACTEC-TB-460系统、BACTECMCIT9600系统、BACTEC9000MB系统、ESP培养系统Ⅱ和MB/BacT系统等MCIT9600系统具有高容量、安全、无交叉污染、无放射性污染、自动存储数据等优点与之相比，BACTEC9000MB系统由于ＭＢ系统含有较多培养基而使标本稀释，因而使检出率大大降低ESPⅡ培养系统检测耗时长，假阳性率高[7]与传统培养法比，全自动培养系统提高了分枝杆菌的分离率，缩短了培养时间，但仍不能完全取代传统培养法，标本在首次分离中可以与传统培养法联合使用，以提高检出率2免疫学技术免疫学技术是以抗原和抗体的特异性结合反应为基础，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌，通过病原体刺激机体产生免疫球蛋白(抗体)的方法2.1酶联免疫吸附试验(ELISA)酶联免疫吸附技术是建立在免疫酶基础上的一种新型免疫测定技术，具有特异性强、敏感性高等优点。

主要应用ELISA方法检测结核病人血清中的特异性抗体或抗原机体受到结核杆菌感染后，体内首先出现的是结核抗原，因此检测结核抗原具有早期诊断价值此方法作为结核病的新型诊断方法敏感性高、特异性强，据张周云等[8]报道此方法的检测敏感性可达84.17%，特异性达92.19%2．2免疫金标技术斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)是免疫金标技术的一种，该方法比ELISA更为简便、快速，全程只需3～5min，并可单人份测定，由于操作简单，检测迅速，检出率高，不需要贵重仪器设备，能快速测定抗结核抗体，是一种较为理想的临床结核病辅助诊断方法[9].陈俊林等［10］试验报道利用此法检测结果与传统菌种鉴定实验的结果符合性很高，敏感度为99.1%，特异度为100%2.3酶联免疫斑点技术酶联免疫斑点(ELISpot)技术是测定Ｔ细胞表面特异的早期分泌抗原-6(ESAT-6)和培养滤出液蛋白-10(CFP-10)本法可区分结核感染者和接种BCG的健康人群优点是灵敏、特异、快速，12h获得结果，有利于结核感染者和活动性结核病人的早期诊断，将成为基础和临床实验研究的标准技术[11]3分子生物学技术3.1聚合酶链反应(PCR)技术PCR技术是一项体外酶促扩增DNA技术，具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点。

有研究显示PCR扩增结核分枝杆菌DNA应用于结核病诊断的准确性为98.8%，特异度为100.0%，敏感度为74.1%，且其敏感度明显高于培养法(43.9%)与涂片法(24.9%)，而且PCR检测结核分枝杆菌DNA仅需6～8ｈ另外，PCR检测不但可以扩增能着色的活菌，还可以扩增已死亡的、但DNA尚未降解的细菌［12］然而该技术存在假阴性，假阳性和污染等问题，随着PCR技术的不断改进和完善，新的PCR及其衍生技术不断建立，在一定程度上提高了PCR方法的敏感度和特异度［13］3.2核酸探针技术核酸探针技术原理是碱基配对互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测迄今为止，DNA探针直接检测临床标本的敏感度并不理想，多数探针只能检出10６CFU/L以上的标本，需依赖培养扩增，因此其临床应用受到了很大的限制有研究显示，DNA探针直接检测TB患者痰标本的阳性率为22.2%，低于涂片抗酸染色检查近年来，在基因探针的基础上研发了一种荧光染料标记肽核酸(PNA)的原位杂交方法，可直接用于临床标本的检测［14］。

基因芯片技术基因芯片技术是20世纪90年代初新兴的分子生物学技术，具有高通量、高度并行性、灵敏度高、特异性强等优点，与传统的细菌培养、生化鉴定、血清分型等检测方法相比，基因芯片可以实现微生物的高通量和并行检测；一次实验即可得出全部结果；操作简便快速，整个检测只需9h基本可以出结果；特异性强，敏感性高[15]有试验结果显示基因芯片法的特异度为100.0%，明显高于金标法(DICA)法和结核菌素纯蛋白衍生物皮试(PPD)法敏感度方面基因芯片法灵敏度为81.6%，明显高于其他方法是一种可靠的新型结核分枝杆菌检测技术[16].4结语综上所述，结核分枝杆菌感染诊断技术很多，但各有利弊全自动培养系统仪器昂贵，成本高，检测周期相对较长PCR技术及基因诊断技术作为临床诊断需要特殊的仪器设备，技术相对复杂，对实验条件和操作人员的要求较高，短期很难大范围推广但相信随着社会的进步和现代科技的发展，结核分枝杆菌相关的检测项目越来越多，检测技术和方法不断进步和发展，检测的方法更加快速、简便，敏感性和特异性更高，这给临床早发现和早诊治结核病提供了极其重要的诊断依据参考文献[1]Globaltuberculosiscontrol：epidemiology，strategy，financing．WHOReport2009WHO/HTM/TB/2009．411.[2]朱翠云．结核病流行及其耐药现状[J]．上海医药，2009，30(1)：11－13.[3]林世平，杨应周，谭卫国，等，环介导等温扩增法快速检测结核分枝杆菌的初步观察[J].中国防痨杂志，2010，32(8):466-469.[4]辛茶香等，噬菌体生物扩增法检测肺结核患者痰标本的临床应用价值[J].现代预防医学，2012，39(8)：1990-1991[5]叶佳庆等，熊国亮噬菌体生物扩增法检测不同标本对结核病临床诊断的意义[J]，实用临床医学，2009，10(6)：11-13[6]于秀丽等，噬菌体生物扩增法检测痰结核分枝杆菌的临床研究[J]，中国实用内科杂志，2007，27(21)：1697-1699[7]谢爱蓉，赵晓春．结核分枝杆菌快速培养法的进展[J]．检验医学，2010，25(4)：327－329．[8]张周云，熊国亮.探讨ELISA法检测血清结核杆菌抗原对肺结核病的诊断价值[J].实验与检验医学，2010，28(6)：537-538.[9]孙国忠，徐云.斑点免疫金渗滤法检测血清抗结核分枝杆菌抗体[J].齐齐哈尔医学院学报，2007.28(2):180-181.，因此深受欢迎。

[10］陈俊林，顾欣荣，顾德林，等．结核分枝杆菌胶体金法对分枝杆菌菌型快速鉴别价值探讨[J]．医学综述，2009，15(18)：2847－2848．[11]庞盼姣，张付贤，李长安.酶联免疫斑点法的研究进展[J].生物技术通报，2010，3:67-71.[12]彭志文．聚合酶链反应检测结核分枝杆菌的临床应用价值[J]．检验医学与临床，2010，07(14)：1490－1491.[13]林青，朱玲．结核分枝杆菌分子生物学检测方法新进展[J]．国际呼吸杂志，2007，27(5)：345－349.[14]李俊明，万腊根．结核病分子生物学诊断研究进展[J]．江西医学检验，2007，25(6)：601－604．[15]杨全凤，基因芯片技术在微生物检测中的应用研究[J]，2012，10(2):67-68[16]张立群，王云霞，周敏，等．４种不同结核分枝杆菌检测方法对结核病的诊断价值比较[J]．中华医院感染学杂志，2010，20(11)：1633－1635．  -全文完-。