病毒TCID50测定.doc

病毒TCID50测定（组织半数感染量）操作步骤(1) 准备细胞 取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）细胞对照选取16个孔即可滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致2) 稀释待测病毒液A法为参考书上标准的操作方法B法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数首次滴定可以多稀释几个滴度根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500µl，即10-1为50µl加入450µl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100µl加入900µl孵育液中。

若接种8个孔，则相应增加液体量上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整此步操作注意事项：1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀2）此过程中需要使用加样器和tip头使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）3) 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样切记：设置正常的细胞对照每次实验要重复4次，计算标准差37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200µl继续在37℃ CO2培养箱中培养4) 培养将培养板放置于CO2培养箱培养温度 ，培养 天5) 测定结果取出培养板，显微镜下观察细胞病变计算方法 1) Spearman-Karber 法 LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + d×∑R1/N1） X0 = 全部病变最低稀释度对数 d = 稀释因数对数 N1 = 每个稀释度所种的孔数 R1 = 病变孔数 ∑ = 积和 LgCCID50 /ml = LgCCID50 /0.2ml +0.72) Reed-Muench法观察CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的TCID50由表看出，能使50%细胞管出现病变的病毒稀释度在10-4~10-5之间，其中间距离比例按Reed和Muench公式计算：TCID50＝高于50%病变的病毒最高稀释度的对数＋距离比例故能使50%细胞管发生病变的病毒稀释度为10-4.5，即TCID50为104.5倍，当病毒悬液做104.5倍稀释时，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时（如中和试验），一般常用100 TCID50/0.1ml。

3) 判定标准细胞对照无病变，在无标准品时，应增加实验次数以减少误差。