蛋白印迹实验报告.docx

精选公文范文 蛋白印迹实验报告篇一:实验十二 Western印迹鉴定 目标蛋白实验十二Western印迹鉴定目标 蛋白实验目的1. 了解Western blot的原理及其意 义，掌握Western blot的操作方法；2. 应用Western blot技术分析鉴定 经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的 重组蛋白实验原理Western印迹法简称蛋白质印迹 法蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后， 凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方 法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸 纤维素膜）上，固相载体以非共价键的 形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质; 以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的 第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同 精选公文范文 位素标记的第二抗体反应，用适当的溶 液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶 液中温育，或通过放射自显影显出谱带， 即可检测出样品中的特异蛋白组分试剂与器材试剂1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml甲醇（20%），定容至 1,000mL；2. 封闭液：5%脱脂奶粉，%叠氮 钠，溶于PBST溶液中；3. 丽春红S（ Ponceaus）染液：丽 春红S溶于1mL冰乙酸中，加水至 100mL；洗膜液：PBS缓冲液含％ Tween 20；5. DAB浓缩显色液（50X）： DAB（二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底 物之一，临用前稀释。

6. 5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解 Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na 精选公文范文 2 精选公文范文 Cl,用/L NaOH调pH至，加水定容至2 升高压灭菌20分钟，室温保存用前 稀释至1x7. SDS-PAGE电泳用溶液和试剂器材电泳装置一套；2. 电转移膜装置3. 抗体-酶反应摇床操作方法〈一〉电转移1. 将蛋白质样品进行SDS-PAGE, 待漠酚蓝跑出胶后停止电泳（1）2. 载手套切6-8张定性滤纸和一 张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小 相同在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸 泡于转移缓冲液中3. 剥胶，并将凝胶裁成合适大小， 切角以做记号（2）4. 按下图示制备“夹心饼”，打开电极板，在一边放上一块纤维垫，再依 次往上叠加3-4张滤纸，将凝胶轻放于 精选公文范文 3 精选公文范文 滤纸上再将一张NC膜放上，加上3-4 张滤纸，每加上一种物品都要精确对齐， 并确保没有气泡再铺上纤维垫，最后 将电极板夹上，夹上夹子插进转膜槽中5. 按下示意图，接上电源（凝胶 一边接负极，尼龙膜一边接正极），恒流 电泳小时，/cm2膜。

6. 关闭电源，将尼龙膜取出，置 塑料盒中用丽春红S染色约5分钟，回 收丽春红S，然后用蒸馏水洗去背景染 料显色，室温稍干燥后用铅笔描下 Marker所在位置，然后用PBST浸泡几 次，完全洗去丽春红S染料（4）〈二〉封闭7. 将膜放入塑料盒中，加入20mL 封闭液，置脱色摇床中缓慢摇动，室温1 小时或4笆封闭过夜（5）〈三〉靶蛋白 与第一抗体结合8弃去封闭液，加入含有第一抗体 的封闭液5〜10mL，室温平缓摇动温育 3小时然后尽量回收抗体溶液，-20°C 保存，可重复使用（6） 精选公文范文 9. 用PBST室温洗膜3次，每次 10 min (7)〈四〉与第二抗体反应10. 弃去PBST溶液，加入适量(〜 5-10mL )含有第二抗体的封闭液，室温 下平缓摇动温育1小时(8)，尽量回收 第二抗体11. 用PBST溶液漂洗尼龙膜3次， 每次10钟〈五〉显色12. 把尼龙膜置于稀释50倍的 DAB溶液中，轻轻摇动，显色约10-30 min，待蛋白带的颜色深度达到要求后， 用水漂洗，最后转移至PBS溶液中，拍 照或扫描(9)注意事项与提示(1) 电泳时间要根据目标蛋白大 小而定2) 为避免干燥，可在胶上滴转 膜缓冲液或浸泡在转膜缓冲液中，使其 离子强度和pH值与转膜缓冲液一致。

3) 可用一圆棒在滤纸上来回滚 精选公文范文 动以驱除气泡4) 染色后整张膜呈红色，由于 丽春红S与膜上蛋白的结合很不紧密， 因此脱背景色时要注意观察，勿将红色 的蛋白带也洗去；脱色完毕，观察转移 效果，并用铅笔在分子量标准带处做上 记号如果用预染的Marker，则不需要 用丽春红染色5) 封闭液的作用是封闭膜上没 有蛋白带的部位，以减少抗体的非特异 结合；我们推荐4°C封闭过夜6) 抗体的用量以浸没尼龙膜为 准，用封闭液稀释第一抗体，抗体的稀 释度要由预实验来定，下列数值可作为 参考：多克隆抗体：1： 100到1： 5000小 鼠腹水：1： 1000 到 1： 10 000(7) PBS对膜上的蛋白没有影响， 但可洗去剩余的封闭液和其它杂质； Tween 20是一种非离子型去污剂，含适 当浓度Tween 20的PBST可洗去非特异 结合的抗体，使整张膜的背景更清晰8) 一般所用的第二抗体(抗免 精选公文范文 疫球蛋白或蛋白质A）为酶标抗体，如 辣根过氧化物酶标抗体或碱性磷酸酶标 抗体第二抗体的稀释度一般为：1： 200 到1： 2000本实验中第一抗体为鼠源单 克隆抗体，因此二抗应选择兔抗鼠抗体， 若一抗为兔源多克隆抗体，二抗应选择 羊抗兔抗体。

9）DAB有致突变之嫌，因此要 戴手套操作；辣根过氧化物酶显色的条 带在阳光下几个小时就会褪色，因此要 尽快拍照实验安排试剂配制一电泳一转移：1天； 杂交一显色一结果处理：约1天 实验报告要求与思考题1. 用数码相机拍下丽春红S染色 和最后抗体显色的结果，计算目标蛋白 的分子量，并对结果加以分析2. 对实验中出现的其它问题进行 分析讨论3. 进行凝胶电泳时应如何选择样 品点样，设置对照？ 精选公文范文 篇二：3蛋白印迹技术《分子生物学实验》实验报告实验名称：蛋白印迹技术 姓名： 陈杰学号：3140104666序号：25同组同学：唐陈曦带教 教师：刘伟俞萍实验日期：2015年9月29日目录1. 原理 ....3印迹技术 3RT-PCR 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳精选公文范文(2D-PAGE) 52. 操 作 步骤 5安装垂直板型电泳装置 5凝 胶 的 制备 5转膜 6封闭 6一 抗 反应 6洗涤 精选公文范文 9 精选公文范文 7二 抗 反应 7洗膜 7检测 73. 实 验 结果 8照 片 记录 8数 据 处理 84. 讨论 精选公文范文 ..101.原理Westen印迹技术蛋白质印迹技术又称免疫印迹技 术和Western印迹技术，是鉴别蛋白质的 分子杂交技术。

Western blotting的原理 是将经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品 转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜、 尼龙膜或PVDF膜）上，固相载体以非 共价键形式吸附蛋白质且能保持电泳 分离的蛋白质的相对位置不变（转膜装 置和预染的标准相对分子质量蛋白的转 膜结果见图8-2-5〜5-2-7）以固相载体 上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的 未标记的一抗起免疫反应，再与酶或同 位素标记的二抗反应，经过底物显色、 化学发光或放射自显影，可以检测电泳 分离的某种特定蛋白成分的存在和含 量该技术也广泛应用于检测某种蛋白 的表达水平Western blotting实验过程主要有 以下几个步骤： 精选公文范文 1、SDS-PAGE分离待检测的蛋白 质；2、转膜：将SDS-PAGE分离的蛋 白质转移到膜上；3、封闭：即利用非 反应活性物质封闭固相载体膜上未吸附 结合蛋白质的区域；4、抗体结合：即 利用相应蛋白质的抗体（一抗）与待测 蛋白质进行免疫结合，再与酶或同位素 标记的第二抗体起反应；5、底物显色或放射自显影检测电 泳分离的特异性目的蛋白的存在与否和 含量Western blotting的转膜方式以电 转移最为常用，固相载体主要有：硝酸 纤维素薄膜、尼龙膜和聚偏二氟乙烯膜 （PVDF膜）。

硝酸纤维素薄膜结合蛋白 的能力为100ug / cm2，综合性能较好， 以往使用的人较多；尼龙膜结合蛋白质 的能力较强，有很高的灵敏度，但结合 背景较高；PVDF-膜具有较好的结合蛋 白质的能力（200ug/cm2），且能较牢固 地结合蛋白质，该膜的机械性能和化学 特性强，不易卷曲或撕裂，在90%甲醇 的脱色条件下也不会影响膜的结构，结 精选公文范文 1 精选公文范文 合在膜上的蛋门质可以直接进行序列分 析，具有较好的染色和检测的兼容性常用的二抗标记物有辣根过氧化 物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等，辣 根过氧化物酶最敏感的底物是3，3’ - 二氨基联苯胺，它在过氧化物酶所在部 位被反应转变成棕色沉淀在钻或镍离 子存在下进行反应可以加深沉淀的颜色 并提高反应的灵敏度但是，使用辣根 过氧化物酶不可能完全排除背景颜色， 因此须十分小心地观察生色反应，一旦 特异性染色蛋白带清晰可见，就应尽快 终止生色反应碱性磷酸酶可催化底物 5-漠-4-氯-3-引哚磷酸/氮蓝四唑在原位转变 为深蓝色化合物这是利用二抗标记物 进行的显色反应.是最早的 Western blotting检测方法，现在主要用于免疫组 化，在显微镜下观察。

该方法的灵敏度 相对较低，可以检测ng水平的目标蛋白 ECL化学发光检测试剂是基于Luminol 的新一代增强型化学发光底物试剂，它 精选公文范文 b 精选公文范文 由辣根过氧化物酶催化发生化学反应， 发出荧光，结果可以通过X光片压片和 其他显影技术展现，或使用Luminometer 检测溶液A主要成分为Luminol及特 制发光增强剂，溶液B主要成分为H2O2 及特殊稳定剂发光液A和B在HRP 的催化作用下Luminol与H2O2反应生 成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即 分解，形成一种能发光的电子激发中间 体，当后者由激发态返回至基态，就会 产生荧光在激发过程中不需要消耗 HRP，HRP只是起催化作用，所以只要 HRP没有降解失活，是可以重复加发光 液进行观察的ECL化学发光检测灵敏 度高，可以检测pg水平的目标蛋白Western blotting 示意图抗原生物素标记一抗的二抗ECL发光试剂RT-PCRRT-PCR是一种在转录水平上检测 基因的方法首先提取组织或细胞中的 总RNA，然后以RNA（主要是mRNA） 精选公文范文 « 精选公文范文 为模板，以与RNA 3 ‘端互补的引物或 Oligo-dT在逆转录酶的作用下进行逆转 录，生成cDNA的第一条链。

然后以 cDNA 3’端互补的引物以及与RNA 3'端 互补的引物组成引物对进行PCR扩增， 最后通过电泳来检测是否产生PCR的扩 增区带，判别目的基因是否表达为了避免由于RNA的降解而导致 阴性的实验结果，在进行RT-PCR时要 设立一个内参照（管家基因的表达），以 避免出现假阴性结果同时内参照可以 对基因表达的变化起到半定量的作用 RT-PCR技术灵敏性高，常用于检测细胞 中是否表达了某种RNA，是基因表达检 测的方法之一聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2D-PAGE）利用蛋白质的等电点和分子量的 差异，通过双向凝胶电泳的方法将各种 蛋白质分离开。