外源基因的表达08.ppt

第8章外源基因表达系统 第一节节 外源基因表达系统第二节节 基因表达的调控元件第三节 表达载体第四节 真核生物基因在大肠杆菌中的表达 外源基因表达系统由基因表达载体和 相应的受体细胞两部分组成 基因表达系统有原核生物基因表达系 统和真核生物基因表达系统第一节 外源基因表达系统据受体细胞的不同可分为：1．原核表达系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原 核细胞中以发酵形式快速高效地表达、 合成基因产物的体系2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系1）大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制 ，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物 （2）基因组结构简单，便于基因操作和分析3）多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于 构建相应的表达载体4）生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚5）不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物 无特定的空间构象6）内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达 产物的不稳定性原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下特点 ： 外源基因在受体细胞中的表达包括转录 和翻译两个环节，它是在一系列酶蛋白和调 控序列的共同作用下完成的 l一、启动子 启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合 酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。

第二节 基因表达的调控元件 1. 原核生物的启动子原核生物的启动子一般由四个部分构成：转录 起始位点、两个六联体保守序列区和间隔区识别区 Pribnow框 转录起点16～19bp 5～9bp 5’ TTGACA TATAAT A（G） 3’ 3’ AACTGT ATATTA T（C） 5’-35序列 -10序列图示： 原核生物启动子结构模式（1）转录起始位点: 大多数细菌启动子转 录起始区的序列为CAT，转录从第二个碱基 开始，该碱基为嘌呤碱基（A/G）2）Pribnow框: 在距转录起始位点上游存 在一个6bp保守序列：TATAAT，由于富含A 、T，又称为TATA box，中间的碱基位于转 录起始点上游的10bp处，又称为 –10序列区 少数Pribnow框中间碱基的位置在 –9～-18之 间变化3）Sextama框: 在转录启动区的另一个六联体 保守序列位于距转录起始位点上游35bp处，通常称 为-35区，该保守序列为TTGACA，其中前三个碱 基具有较强的保守性，它是RNA聚合酶的识别位点 。

4）间隔区: 原核生物启动子在转录起始位点与 Pribnow框之间、Pribnow框与Sextama框之间存在 长度不等的间隔序列间隔序列内部无明显的保守 性，其序列的碱基组成对启动子的功能并不十分重 要, 但间隔序列的长度却是影响启动子功能的重要 因素 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间 隔序列 原核RNA聚合酶不能识别真核基因的启 动子原核表达系统中通常使用可调控的强启 动子有Lac、Trp、PL、Tac等 一般认为，大肠杆菌RNA聚合酶识别 并结合启动子-35区和RNA聚合酶亚基结 合，-10区和RNA聚合酶的核心酶结合，在 转录起始位点附近，DNA被解旋形成单链 ，RNA聚合酶使第1和第2核苷酸形成磷酸 二酯键，以后RNA聚合酶向前推进，形成 新的RNA链 根据真核基因编码的产物和RNA聚合酶的 种类可把真核生物的启动子分为三类： l Ⅰ型启动子: rRNA基因启动子l Ⅱ型启动子: mRNA基因启动子l Ⅲ型启动子: tRNA启动子 2．真核生物的启动子所属的基因绝大多数为编码蛋白质 Ⅱ型启动子也具有 两个高度保守的共有序列其一是在－25附近的一段AT富集 序列，其共有序列是TATAA，称为为TATA盒。

TATA盒与原 核的Pribonow盒相似，是与DNA双链的解链有关，决定转录 的起始其二是在多数启动动子中，-70附近共有序列CAAT区 ，称为为CAAT盒，与RNA酶的结合有关除以上两个区域外 ，有些启动动子上游中含有GC盒，是转录转录 因子与DNA分子此 它们们可影响转录转录 起始的频频率启动动子决定了被转录转录 基因的启 动频动频 率与精确性，同时时启动动子在DNA序列中的位置和方向是 严严格固定的，是由5′到3′方向Ⅱ型启动子 ： 转录终止过程包括： （1）RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进， RNA的延伸也停止在终止信号上； （2）完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来 ；（3）RNA聚合酶从模板上释放出来 二 终止子（terminator，T）:位于基 因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信 号的DNA序列 对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上 有一些共同的特点，有1段富含A/T的区域和1段富 含G/C的区域，G/C富含区域又具有回文对称结构 ，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构 并且有与A/T富含区对应的一串U G/C富含区2 G/C富含区1 A/T富含区DNA …NNAA GCGCCG NNNN CCGGCGC TTTTTT NNN ……NNTT CGCGGC NNNN GGCCGCG AAAAAA NNN … RNA … NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OHN N NN CG C C GC G RNA结构 G C C G G C A U A U ……NNNN UUUU-OH3 图： 强终止子模式图mRNA的翻译起始效率主要由其5’端的结构序列 所决定，称为核糖体结合位点（RBS），它包括下列 四个特征要素： l （1）位于翻译起始密码子上游的6至8个核苷酸 序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno(SD)序列 ，富含嘌呤核苷酸，通过识别大肠杆菌核糖体小亚基 中的16S rRNA 3’端的富含嘧啶区域3’AUUCCUCC5’ 并与之专一性结合，将RNA定位于核糖体上，从而启 动翻译。

l 三、SD序列:lSD序列是核糖体RNA的识别和结合位点 （2）翻译起始密码子，大肠杆菌绝大 部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点 ，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻 译起始密码子 （3）SD序列与翻译起始密码子之间的 距离及碱基组成 （4）基因编码区5’端若干密码子的碱 基序列在组成蛋白质的20种氨基酸中，只有甲硫氨酸 和色氨酸仅对应唯一的密码子，另外18种氨基酸均 拥有2至6种不同的密码子，这些编码相同氨基酸的 不同密码子称为简并密码子 在E. coli中，并非每一种密码子都拥有自己的 tRNA，同一种tRNA分子往往可以识别多种简并密 码子 四、密码子： 采用外源基因全合成的方法，按照大肠杆菌密码 子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相 应简并密码子 l 原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率 具有不同程度的差异性，因此，外源基因尤其是哺 乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素 是密码子的正确选择 增强子（enhancer）是能够增强启 动子转录活性的DNA顺式作用序列 增强子的结构类似启动子，由多个 元件组成，每个元件可以与一种或多种 转录调控因子结合。

转录调控区通常含有多个自主的增 强子，每个长50～1500bp不等每个 增强子都有一种特定的功能五、增强子:六、翻译终止子如果用UAAU来终止翻译，效率会增加第三节 表达载体1. 表达载体： 适用于在受体细胞中表达外源 基因的载体•主要元件：强启动子 转录终止子SD顺序 增强子 翻译终止子其它调控基因 启动子：建立表达载体时，选择强启动子 常见原核强启动子：•Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导•Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子•Ptac : Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子•PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子， 受λ噬菌体cI基因负调控温度诱导 （1）融合型表达载体:融合蛋白例如: pGEX系统（2）非融合型表达蛋白载体:天然完整 蛋白 例如: pKK223-3（3）分泌型克隆表达载体:产物可跨膜 分泌至胞周间隙 例如: pIN-III系统2. 常见的表达载体（1）融合型表达载体 PSDForeign DNA融合型表达载体融合基因位相载体----含有3种读码框的系列载体Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白—直接纯化产物切割方便：pGEX-1TpGEX-2TpGEX-3T位相载体（2）非融合型表达载体 PSDForeign DNA非融合型表达载体非融合基因非融合型表达载体----pPL-LamdaPL启动子---温度 诱导插入位点--HpaI（3）分泌型表达载体：1、主要元件：启动子和SD序列信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解。

分泌型表达载体----pINIII-ompA1分泌型融合表达载体----pEZZ18第四节 真核生物基因在原核表达系统中的表达一、外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：1. 删除内含子和5’非编码区2. 外源基因置于强启动子和SD顺序控制下3. 维持正确开放阅读框架（ORF）4. mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解5. 调控外原基因的表达，防止表达产物对寄主菌的毒害 二、 外源基因在大肠杆菌表达的形式表达产物可能存在于细胞质、细胞周质和细胞 外培养基中, 其表达形式有:（1）包涵体蛋白（2）融合蛋白（3）整合型外源蛋白（4）分泌型外源蛋白外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚 集在一起形成无膜的裸露结构，称为包涵体 包涵体主要存在于细胞质中，在某些条件下也能 在细胞周质中形成包涵体主要由蛋白质组成，并且大部分蛋白质为 外源基因的表达产物，它们具有正确的氨基酸序列， 但空间构象却是错误的，因而一般没有生物学活性在包涵体中还含有受体细胞本身的一些表达产物 ，如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体 编码的蛋白等此外还包括DNA、RNA和脂多糖等非蛋 白分子。

（1）包涵体蛋白： 以包涵体形式表达的外源蛋白最突出 的优点是易于分离纯化，因为包涵体的水难 溶性和密度远大于其他蛋白，通过高速离心 即可与其他蛋白区分开来包涵体对蛋白酶也表现出较好的抗性 将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在 一起，但不改变两个基因阅读框，以这种方式表达 的蛋白成为融合蛋白 受体菌蛋白位于N’端，外 源蛋白位于C’端外源蛋白与菌体自身蛋白以融合蛋白的方式表 达后:稳定性大大增加具有较高的水溶性和一定的生物学活性表达能以较高的效率进行并且易于分离纯化 （2）融合蛋白l在融合蛋白被表达之后，必须从融合蛋 白中将原核多肽去掉常用的有化学降 解法及酶解法，一般而言，化学降解法 缺乏选择特异性，且反应条件剧烈（如 溴化氰）；而酶解法特异性较高，但切 割效率不高 将要表达的外源基因整合到染色体的 特定位置上，使之成为染色体结构的一部分 而稳定地遗传和表达 为了获得含有整合基因的重组体，被选择 的载体一般是那些不能在受体细胞内进行自 主复制的质粒 （3）整合型外源蛋白： 分泌型蛋白是指外源基因的表达产物通过运输 或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中 以分泌型蛋白的形式表达外源基因具有以下优点： (1)简化了发酵后处理的纯化工艺； (2)减少了外源蛋白在细胞内被蛋白酶降解的概率 ； (3)通过对分泌表达的设计有利于形成正确的空间 构象，获得有较好生物学活性的蛋白质。

外源基因以分泌型蛋白表达时，须在N端加入信 号肽。