肉苁蓉苯乙醇苷对大鼠精子体外氧化损伤保护作用探究.doc

肉双蓉苯乙醇昔对大鼠精子体外氧化损伤保护作用探究作者：李刚，朱文斌，牛飞，张宏利【摘要】目的观察肉芨蓉苯乙醇昔对大鼠精子膜结构和氧化损伤的干预作用,探讨肉芨蓉苯乙醇昔治疗弱精子症 男性不育的作用机制方法取大鼠精子制备精子悬液，并分 为正常组，药物空白组，模型组，阳性药对照组(维生素C组) 和肉芨蓉苯乙醇昔提物小、中、大剂量组，应用FeS04/H2O2体系产生活性氧(ROS)，在有氧环境下，不同剂量 (0.025, 0.25, 0.5 g/ml生药量)的肉芨蓉苯乙醇昔与精子悬液共同孵育后，检测精子膜脂质过氧化损伤程度，通过精子低渗 膨胀试验评估精子膜功能,并与已知的抗氧化剂维生素C对 照结果肉双蓉苯乙醇昔小、中、大剂量组(0.025, 0.25, 0.5 g ml- 1)在相同的条件下均可提高精子悬液SOD活力，降低 MDA含量，对精子膜功能具有一定的保护作用其中0.25,>1!0.5 g-ml- 1的肉茨蓉苯乙醇昔组明显优于维生素C组(P&t;0.01或P&It; 0.001) o结论肉芨蓉苯乙醇昔对大鼠精子膜的 脂质过氧化损伤具有明显的干预作用,对精子膜结构和功能具有明显的保护作用关键词】肉双蓉；苯乙醇昔；精子；脂质过氧化肉芨蓉作为一种名贵的中药材，近年来对它的研究较多。

肉茨蓉的活性成分主要包括苯乙醇昔类化合物(Phenylethanoid glycosides , PhGs \ 肉芨蓉多糖、甜菜碱、黄酮等物质，其中PhGs是肉芨蓉中最为重要的活性成分之一PhGs是一类含有軽基、甲氧基取代苯乙基和轻基、甲氧基取代肉桂酰基的化合物，通常以价葡萄糖为母核的含有1!酯键及氧昔键的天然糖昔，广泛存在于双子叶植物中苯乙醇 昔类化合物主要由咖啡酸、苯乙醇昔元和糖三部分组成，包>1!>1!括海胆昔(Echinacoside )、麦角留昔(Acteoside)、异麦角笛昔(Isoacteoside)'乙酰基麦角苗昔(acetylacteoside)等许多研究结果表明，苯乙醇昔类化合物 具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、增 强记忆及性机能等作用由于PhGs分子含有多个酚耗基， 能够结合体内自由基，避免其在体内的大量蓄积，保护机体 免受过量氧化损伤，是抗氧化和抗衰老的主要成分[1 ]□尽管肉芨蓉以复方形式多次出现在治疗男性少精、弱精疾病的中药配伍中［2 ］,但就其所发挥作用的机理研究尚 不全面除去其可呈现出的雄性激素和促性腺激素样作用进 而提高精子数量和活力的作用外［3 ］,研究其抗氧化功效在 治疗弱精、少精疾病中所做贡献还是新的尝试。

本文以肉芨 蓉提取物对大鼠精子体外膜功能氧化损伤的保护作用为题， 体外应用FeS04 / H2O2体系建立氧化应激损伤［4 ］,探讨 肉芨蓉抗氧化功效在治疗这类疾病中所发挥的作用1材料干燥管花肉双蓉肉质茎（购自内蒙古中蒙医院）电 子天平PL2002 ,自制色谱柱（1.5 cmx20 cm ）,旋转蒸发仪（上海亚荣仪器厂），大孔吸附树脂，玻璃容器若干，高 速台式离心机，水浴锅，二氧化碳细胞培养箱（SANYO ），酶 标仪，血球计数板SOD试剂盒、MDA试剂盒（南京建成 生物工程研究所），低渗膨胀液:柠檬酸钠0.735 g,果糖1.351 g,双蒸水100 mlo伊红Y溶液:伊红Y0.5 g,溶于等渗生理盐 水100 mlo雄性Wistar大鼠［购自内蒙古大学实验动物中心，实验动物批号:SCXK（蒙）2002_0001 ］,体质量（200±20 ） g2方法 2.1肉茨蓉苯乙醇昔的提取、分离［5］取干燥的肉芨蓉30g，粉碎后过20目筛加入8倍量70%乙醇，以709 提取，提取两次，合并两次提取物按图1操作后浓缩药液, 用聚乙烯微孔滤管过滤，浓缩药液至相当于生药量0.5g ml-1 ,冷藏保存。

2.2正常精子悬液制备［6 ］取数只大鼠附睾，置于温浴37°C PBS ,洗去毛发和血液，转至有20 ml PBS的培养皿中，剪开附睾头部，待精子充分游离后，将上清液用200 目滤网过滤，反复操作至上清液变清，计数板计数，用PBS 调整细胞浓度为2x107个/ml2.3大鼠精子过氧化损伤模型的建立将精子悬液分为 6组：正常组为PBS缓冲液（pH 7.14） ; FeSO4 / H2O2 组（FeSO4 终浓度 0.02 mmol-L-1, H2O2 终浓度 1 mmol-L-1 ）:阳性药对照组为维生素C （终浓度为0.25 mg-ml- 1 ） + FeSO4 / H2O2 （ FeSO4 终浓度 0.02 mmol-L-1, H2O2终浓度1 mmol-L-1 ）;肉芨蓉小、中、大剂 量组为肉芨蓉提取物（终浓度分别为0.025, 0.25, 0.5 g ml-1 ） + FeSO4 / H2O2 （终浓度同模型组）；各组样本置37 °C , 5%CO2培养箱中孵育0.5ho2.4总超氧化物歧化酶仃-SOD）活力测定精子悬液孵育2 h,按试剂盒说明书操作，用分光光度计测定波长550 nm处比色，结果以每毫升酶单位表示。

SOD活力单位为抑制反应50%的SOD量SOD活力（U -ml-1 ） =（A对照-A样品）+A对照十50%><样品稀释倍数2.5丙二醛（MDA）含量测定精子悬液孵育2 h,按试剂 盒说明书操作，用分光光度计测定波长532 nm处比色精子膜脂质过氧化损伤的程度以MDA的产量来表示（nmol/107 个精子）MDA量（nmol/107个精子）=（A样品・A空白）-（A 标准-A空白）x对照品浓度（10 nmol ml-1 “样品稀释倍数2.6精子存活率测定精子悬液经温育30 min和90min后分别取5 pl与等量的曙红・Y混匀，室温下放置2 min ,加盖玻片，在明视野400x显微镜下15 min内观察，死精子被染色呈粉红色，活精子不被染色而胞质透明每份标本计 数200个精子计算存活率2.7精子低渗膨胀实验（HOS）取低渗肿胀试剂1 ml , 37°C预温5 min ,分别加入处理过的精液100 pl混匀，37°C 水浴孵育30 min，取5 pl精子悬液于精子计数盘中，计算 200个精子中b-g型肿胀精子的百分率3结果3.1肉双蓉苯乙醇昔定性鉴定采用薄层层析法对肉茨蓉中PhGs定性分析，正丁醇■乙酸■水（5:4:1 ）为展开剂， 展开晾干后,喷以氯化铁•乙醇显色剂。

PhGs含有酚超基，会与Fe3+发生反应显紫色测得Rf值0.24和0.78较明显，与文献松果菊柑和麦 角宙昔0.23和0.73基本吻合3.2肉茨蓉PhGs对于大鼠精子氧化损伤后对精子存活率的影响精子悬液孵育30 min后各组的精子存活率由于实验条件的原因，存活率均有降低维生素C组和肉芨蓉提 取物小、中、大剂量组的精子存活率显著高于模型组 (P<0.001); 30 min 和 90 min 的精子活率,0.025 g-ml-1 肉 芨蓉提取物组与维生素C组无明显差异，0.25和0.5 g ml-1 肉芨蓉提取物组的精子存活率显著高于维生素C组 (P<0.01或P&t;0.001) ; 90 min后精子存活率进一步降 低，0.5 g ml-1肉芨蓉提取物组的精子存活率保持在较高水 平，与正常组相比无显著差异(见表1)表1各组30, 90 min 精子存活率(略)3.3对精子尾部低渗膨胀试验的影响低渗膨胀试验通过低渗溶液来检测精子尾部细胞膜的状况，从而了解其运动 机能的实验方法g型精子尾部全部膨胀，表示细胞膜无损, 机能良好在精子低渗膨胀率试验中，模型组显著低于正常组(P<0.001)o其中,精子的总膨胀率(b・g型)[7,8]:肉 双蓉提取物小剂量组与维生素C组相比无显著性差异，中、 大剂量组显著高于维生素C组(P<0.001 ),甚至接近正常 组；对于g型精子膨胀率影响，0.025 g-ml-1肉茨蓉提取物 组与维生素C组(0.25 mg-ml-1 )相比无显著性差异,但中、大 剂量肉茨蓉提取物组显著优于维生素(3组(P&t; 0.01)o见 表2。

表2各组精子尾部低渗膨胀实验结果(略)3.4肉茨蓉PhGs对于大鼠精子氧化损伤后T-SOD活力、MDA含量的影响精子悬液孵育0・5h后，模型组的T-SOD 活力显著低于正常组(P<0.001) ,MDA量显著高于正常组 (P<0.001);维生素C组和肉芨蓉提取物小、中、大剂量组 的T-SOD活力明显高于正常组和模型组(P均<0.001),MDA量显著低于模型组(P&t;0.001)o对SOD活 力和MDA量的影响,0.025 g-ml-1的肉双蓉提取物组与维生素 C 组(0.25 mg-ml-1)之间无明显差异；0.25, 0.5 g-ml-1的肉芨蓉提取物组显著优于维生素C组(P&t; 0.05) o见表 3o与维生素C组比较P&t; 0.001c而药物空白组中与正常组无显著性差异表3 PhGs对于精子氧化损伤后T-SOD活力、MDA含量的影响(略)4讨论ROS包括氧离子，自由基和超氧负离子，是由精子和 精子粒细胞产生并主要通过两种机制导致不育第一，它破坏精子细胞膜，降低精子活力以及和卵子结合的能力；第二, ROS可以改变精子DNA，导致缺陷的父系DNA作用于孕体。

我们已知精子膜富含多聚不饱和脂肪酸，在有氧条件下极不 稳定，易发生精子膜脂质过氧化(lipidperoxi dation, LPO)，使 膜的液态性、流动性及通透性发生改变，造成精子膜的损伤， 甚至细胞死亡MDA作为LPO反应的最终产物之一，其含量 可从一定程度上反映精子膜LPO损伤情况［9 SOD是精子所拥有的防御ROS的主要酶系低渗膨胀试验：为WHO 推荐的一种可供选择的检查精子存活力的补充试验方法部分学者认为，精子低渗膨胀实验可作为精子膜功能指标之本文应用FeSO4 / H2O2体系产生ROS，造成氧化应 激损伤模型，研究了肉双蓉提取物对大鼠精子膜结构和功能 氧化损伤的保护作用结果表明，在ROS的作用下大鼠精子膜结构和功能明显受到损伤，精子悬液T-SOD活力显著降低MDA含量显著增高，精子膨胀率(总膨胀率、g型精子膨胀 率)明显降低，精子存活率显著下降，与正常组相比差异极显 著(P<O.OO1) o肉双蓉提取物小、中、大剂量组(0.025,0.25, 0.5 g ml-1)在相同的条件下均可提高精子悬液SOD活力，降 低MDA含量，对ROS所致精子膜的氧化损伤均具有不同程 度的干预作用，对精子膜功能具有一定的保护作用。

肉芨蓉提 取物的作用呈剂量依赖性，大剂量(0.5 g-ml-1)时对精子膜功能的保护作用最显著肉茨蓉具有抗氧自由基活性，对轻自由 基及超氧阴离子自由基均有良好的清除作用o本实验结果显示，适量肉芨蓉提取物能显著提高精子悬 液SOD活力，降低MDA含量，抑制精子膜脂质过氧化反应, 发挥抗氧化作用，对精子膜结构和功能具有明显的保护作 用这可能是在已有的可呈现出雄性激素和促性腺激素样作用外，肉茨蓉在治疗弱精子症男性不育中所表现出的另一项 新药理机制参考文献】[1 ] Muteliefu Gulinuer, Liu Mingju, Lu Jingfen,et al. Effect of Cistanoside Compounds on Oxidative Stress and Immunity J ].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences。