生化工艺实训PPT土壤中分离筛选出产淀粉酶的芽孢杆菌方法.ppt

生化工艺实训生化工艺实训第五组第五组实训项目名称：产淀粉酶芽孢杆菌分离筛选及发酵一、实训目的一、实训目的1、掌握培养基的配制方法和菌种的分离技术2、掌握各级种子制备技术3、了解培养基和空气系统的灭菌原理，掌握灭菌技术4、熟悉和掌握接种操作5、了解小型发酵罐的基本结构，掌握发酵罐的使用方法6、熟悉和掌握常用的比色分析技术7、了解细菌培养过程的代谢变化二 实训内容：1.产淀粉酶芽孢杆菌的初筛2.产淀粉酶芽孢杆菌的复筛3.目的菌株的保藏4.产淀粉酶芽孢杆菌的发酵及控制（1）种子的扩大培养（2）培养基的制备（3）发酵系统的灭菌（4）接种（5）发酵条件的控制一一.产淀粉酶芽孢杆菌初筛产淀粉酶芽孢杆菌初筛•1.实验材料实验材料•a. 样品样品 乐购超市后草坪中土壤5g•b.仪器仪器 试管、移液管、锥形瓶、涂布器 、平皿、超净台、水浴锅、玻璃棒、玻璃球等 •c.培养基培养基 :牛肉膏2.5g 蛋白胨5g 氯化钠2.5g 可溶性淀粉1g 蒸馏水500ml 琼脂2% pH7.22.初筛方案5g土壤45ml无菌水玻璃珠10-1土壤菌悬液摇床震荡10分钟85℃水浴15分钟10-2 10-3 10-4 10-50.1ml涂布培养涂布培养涂布完放入恒温箱中培养，待长好涂布完放入恒温箱中培养，待长好后加碘液，选出后加碘液，选出12株透明圈大的菌株透明圈大的菌种，具体测量其透明圈和菌落直径种，具体测量其透明圈和菌落直径。

3.初筛结果菌号透明圈直径D/mm单菌落直径d/mmD/d1321.52---33.521.75431.525---6321.574.522.258321.592.51.51.6710---11321.512623表一 初筛结果（1）分区划线培养分区划线培养把上面选出的把上面选出的12株菌种，进行分区划线培养株菌种，进行分区划线培养取不同形态生长旺盛的菌落1 23 45 67 891011 12分区划线培养分区划线培养1 23 45 67 891011 12分区划线培养的结果分区划线培养的结果点接培养点接培养取上述划线培养的结果，一份用于菌种保藏，一份用于点接培养取上述划线培养的结果，一份用于菌种保藏，一份用于点接培养点接方法如下所示点接方法如下所示:173245689101112点接培养点接培养152432419678859101011111212367点接完放点接完放入恒温培入恒温培养箱培养，养箱培养，待长好后待长好后加碘液，加碘液，具体测其具体测其菌落及透菌落及透明圈直径明圈直径点接培养的结果点接培养的结果菌号透明圈直径D/mm菌落直径d/mmD/d平均值31171.571.8816.57.52.27138.51.531.57127.51.691181.3751.3611.58.51.351221141.51.5521.513.51.6表二 初筛结果（2）革兰氏染色主要步骤：涂片 干燥 固定 初染(结晶紫染色1-2min) 水洗 媒染 (卢戈氏碘液媒染1min) 95%乙醇脱色(30S) 水洗 复染(番红复染约1min) 水洗 干燥 镜检 菌号形态颜色结果判定（阳或阴）3红阴7蓝紫阳9红阴12蓝紫阳表三 革兰氏染色结果芽孢染色•主要步骤：涂片 干燥 固定 染色(3-5滴5%孔雀绿染液，放在酒精灯上方微微加热至沸腾，开始计时5min，加热过程中勿使染料干涸，必要时要随时补充少许染料) 水洗 复染(复染2min) 水洗 干燥 镜检菌号形态着生位置颜色3中生芽孢为绿色，菌体为红色7端生芽孢绿色，菌体红色9端生芽孢绿色，菌体红色12中生芽孢绿色，菌体红色表四 芽孢染色结果 二二.产淀粉酶芽孢杆菌的复筛产淀粉酶芽孢杆菌的复筛•实验材料实验材料•a样品 初筛所得4株菌种 •b 仪器 分光光度计、离心机、带有过滤膜的过滤器、移液枪、注射器、牛津杯、枪头、针头、平皿等•c 淀粉检测培养基：淀粉0.4g 蒸馏水200ml 琼脂2% PH7.2•d试剂 DNS试剂 葡萄糖标准溶液 1%淀粉溶液DNS法测定淀粉酶活力•一原理•在NaOH和丙三醇存在下3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。

在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈橘红色，在540nm波长处有最大吸光值，在一定浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量OHNO2NO2COOH+ 还原糖OHNH2NO2COOH(DNS)(3-氨基-5-硝基水杨酸）管号葡萄糖含量蒸馏水葡萄糖含量OD540nm001.00010.20.80.40.15420.40.60.80.31830.60.41.20.48440.80.21.60.67251.002.00.824二、制作葡萄糖标准曲线，取二、制作葡萄糖标准曲线，取6只试管，按下表加入只试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖溶液葡萄糖溶液和蒸馏水和蒸馏水在上述试管中分别加入在上述试管中分别加入DNS试剂试剂2.0mL于沸水中加热于沸水中加热2min进行显色，取进行显色，取出后用水迅速冷却，各加入蒸馏水出后用水迅速冷却，各加入蒸馏水9mL，摇匀 在在540nm波长处测定的吸光值，以波长处测定的吸光值，以0号试管号试管作为空白试验，以葡萄含量作为横坐标，光吸收作为空白试验，以葡萄含量作为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线，如下所示值为纵坐标，绘制标准曲线，如下所示：三、酶活测定发酵液离心处理：8000r,5min取1mL上清液+5mL1%淀粉溶液于37度水浴5min沸水浴5min（使酶失活） 去上述处理液1mL+DNS试剂2mL沸水浴，取出后迅速冷却+9mL蒸馏水，摇匀540nm波长处测其吸光值上清液+1%淀粉溶液直接加热煮沸+DNS试剂（空白）菌号样品0D值葡萄糖含量/mg酶活u/ml(发酵液）平均值30.0060.034760.231720.247743’0.0080.039560.2637670.0030.027570.183780.191827’0.0040.029970.199890.0190.065930.439560.471549’0.0230.075520.50346120.0170.052750.351660.411612’0.0210.070730.47154表五 DNS法测定发酵液酶活结果公式：样品葡萄糖含量公式：样品葡萄糖含量X6X103÷180÷5淀粉酶的酶活单位（淀粉酶的酶活单位（u）：在）：在37℃℃下，每分钟生成下，每分钟生成1umol葡葡萄糖所用的酶量为一个酶活单位萄糖所用的酶量为一个酶活单位【【1umol/min】】二、平板扩散法发酵液发酵液离心离心过滤（除菌体）过滤（除菌体） 1.牛津杯法：把灭好菌的牛津杯放到提前倒好培养基并已凝牛津杯法：把灭好菌的牛津杯放到提前倒好培养基并已凝 固的平皿中，每个平皿中放固的平皿中，每个平皿中放4个，用移液枪取过滤好的上清个，用移液枪取过滤好的上清 液液100uL 到到 牛津杯中（培养基厚度、移液量、枪头大小要牛津杯中（培养基厚度、移液量、枪头大小要 一致一致 ），一个菌种用一个平皿，），一个菌种用一个平皿，4个菌种操作完毕后，放个菌种操作完毕后，放点样点样 到到37度培养箱中度培养箱中【【水解水解】】（不能倒置培养）（不能倒置培养） 2. 打孔法打孔法:先用枪头去提前倒好培养基并已凝先用枪头去提前倒好培养基并已凝 固的平皿中打孔固的平皿中打孔 （使用枪头大小、培养基厚度要一致），用移液枪取过滤好的（使用枪头大小、培养基厚度要一致），用移液枪取过滤好的 上清液上清液100uL到所打的孔中（移液量要一致），到所打的孔中（移液量要一致），1个菌种用个菌种用1 个平皿，个平皿，4个菌种操作完毕后，放到个菌种操作完毕后，放到37度培养箱中度培养箱中【【水解水解】】 （不能（不能 倒置培养）倒置培养） 牛津杯法加碘液后结果菌号透明圈直径一/mm平均值透明圈直径二/mm平均值314/1313.5-3’11/1010.5-79/1110-7’7/77-910/1110.5-9’7/87.5-12-/8--12’12/1111.5-点样量100uL-牛津杯直径/mm7孔径/mm8表六 平板扩散复筛结果综合分析: 根据初筛和复筛结果可知，12号菌产淀粉酶活力高 。

初筛结果：1.D/d=3 2.D/d=1.55 复筛结果： DNS法酶活=0.4116u/mL 牛津杯法 -/8 12/11 所以选择12号为最好菌种，复筛结束三.菌种的保藏•1.试管斜面保藏：•a接种：去两支无菌试管倒入培养基做斜面，用接种环将保存在4度冰箱中的12号菌种以无菌操作的方式在斜面上划线•b培养：37度恒温培养箱中培养16-24ｈ，贴上附有菌种详细信息的标签•c保藏：斜面长好后，直接放入4度冰箱中保藏（密封）斜面保藏菌种２.甘油管冷冻保藏•a．甘油灭菌：将1mL甘油和1mL蒸馏水加入甘管中，混匀放到灭菌锅中灭菌•b. 接种培养：用移液管移取2mL液体培养的菌液于甘油管中，震荡使菌液充分混匀，贴上标签•c.将甘油管置于-20度冰箱中进行保藏•d.此方法所用甘油浓度为25%甘油管保藏菌种四四.产淀粉酶芽孢杆菌的发酵及控制产淀粉酶芽孢杆菌的发酵及控制•1.种子的扩大培养10%接种量液液接种456固液接种100mL培养基培养基10%接种量液液接种液液接种10%接种量（8瓶）（8瓶）（9瓶）100mL培养基培养基100mL培养基培养基100mL培养基培养基50L5%接种量2.5L2.空气过滤器除菌 •a.在空消前，必须先对空气过滤器进行消毒。

•b.消毒前，先打开过滤器底部的排污阀，排尽冷凝水•c.消毒温度121度，压力0.11-0.12Mpa之间，时间25-30min•d.待蒸汽杀菌还有5min左右结束时，打开空气压缩机为下一步吹干做准备•e.吹干，吹干时间25-30min•注意空气流量计不能通入蒸汽3培养基的配制及灭菌 培养基配方培养基配方：牛肉膏：牛肉膏250g 蛋白胨蛋白胨500g 氯化钠氯化钠250g 可溶性淀粉可溶性淀粉100g 蒸馏水蒸馏水50L pH7.2 实消实消:a.投料结束后，启动电机，慢速搅拌投料结束后，启动电机，慢速搅拌 b.微开夹套排污阀，打开夹套蒸汽阀，保持夹套压力为微开夹套排污阀，打开夹套蒸汽阀，保持夹套压力为0.1Mpa左右，待培左右，待培 养基预热达到养基预热达到95度以上时停止搅拌，关闭夹套蒸汽阀，开大夹套排污阀度以上时停止搅拌，关闭夹套蒸汽阀，开大夹套排污阀 c.培养基温度达到培养基温度达到95度后，缓慢打开进气阀及底阀处的蒸汽阀，同时向罐内度后，缓慢打开进气阀及底阀处的蒸汽阀，同时向罐内 进气，待罐压升至进气，待罐压升至0.11Mpa后，打开罐面排气阀进行排气。

后，打开罐面排气阀进行排气 d.调节罐面排气阀，保持罐压调节罐面排气阀，保持罐压0.11Mpa，维持温度咋，维持温度咋121-123度之间，计时度之间，计时 实消实消20min e.实消完毕，关闭底阀处的蒸汽阀实消完毕，关闭底阀处的蒸汽阀 f.在关闭进气阀处的蒸汽阀的同时打开在关闭进气阀处的蒸汽阀的同时打开NB型过滤器的出气阀，进行换气保持型过滤器的出气阀，进行换气保持罐压在罐压在0.05-0.08Mpa之间 g.关闭夹套排污阀后，迅速打开夹套手动进水阀进行降温，当培养基温度降关闭夹套排污阀后，迅速打开夹套手动进水阀进行降温，当培养基温度降到到90度左右时，开搅拌低速控制度左右时，开搅拌低速控制 h.当培养基温度比发酵罐所需温度高当培养基温度比发酵罐所需温度高1-2度，关闭夹套手动进水阀，等待接种度，关闭夹套手动进水阀，等待接种 倒培养基4.接种 火焰圈法接种：火焰圈法接种： a.准备好合格的摇床菌种，接种量准备好合格的摇床菌种，接种量5% b.用用75%酒精棉球擦洗进料口四周，放上接种火焰圈，并酒精棉球擦洗进料口四周，放上接种火焰圈，并在接种火焰圈内围上酒精棉球。

在接种火焰圈内围上酒精棉球 c.减少进气量，控制罐压在减少进气量，控制罐压在0.02Mpa左右后，点燃接种火左右后，点燃接种火焰圈内的酒精棉球焰圈内的酒精棉球 d.拧下进料口螺盖，放入盛有酒精的烧杯中拧下进料口螺盖，放入盛有酒精的烧杯中 e.将接种瓶的瓶口在火焰上烧一下，并在火焰的保护下拔将接种瓶的瓶口在火焰上烧一下，并在火焰的保护下拔下瓶塞，迅速将菌种倒入发酵罐内下瓶塞，迅速将菌种倒入发酵罐内 f.旋上进料口螺盖后灭火焰，拧紧螺盖，并用酒精棉球擦旋上进料口螺盖后灭火焰，拧紧螺盖，并用酒精棉球擦洗干净 g.重新调整进风量，保持罐压在重新调整进风量，保持罐压在0.05-0.08Mpa 接种速度要迅速，罐压不能为接种速度要迅速，罐压不能为0，否则会导致染菌，否则会导致染菌接种发酵过程控制 产淀粉酶芽孢杆菌生长量的测定接种后5分钟取第一次样，以后每隔半小时取一次样，用分光光度计 测产淀粉酶芽孢杆菌的生长量取样表七 菌体浓度的测定培养时间（h）菌液的OD值（稀释5倍）菌液的OD值（未稀释）00.0630.3170.50.0720.31910.0770.3661.50.1060.48420.1730.7032.50.2551.09730.3821.3103.50.5131.60240.6841.7214.50.8241.88650.8891.921菌体浓度生长曲线酶活测定•发酵液酶活测定 •待菌种发酵2.5小时，取第一次样用DNS法测发酵液酶活，发酵4.5小时，取第二次样，用同样方法测发酵液酶活。

二、制作葡萄糖标准曲线，取二、制作葡萄糖标准曲线，取6只试管，按下表加入只试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖溶葡萄糖溶液和蒸馏水液和蒸馏水管号葡萄糖含量蒸馏水葡萄糖含量OD540nm001.00010.20.80.40.15520.40.60.80.31530.60.41.20.48540.80.21.60.64651.002.00.788在上述试管中分别加入在上述试管中分别加入DNS试剂试剂2.0mL于沸水中加热于沸水中加热2min进行显色，取进行显色，取出后用水迅速冷却，各加入蒸馏水出后用水迅速冷却，各加入蒸馏水9mL，摇匀 在在540nm波长处测定的吸光值，以波长处测定的吸光值，以0号试管作为空白试验，以葡萄号试管作为空白试验，以葡萄含量作为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线，如下所示含量作为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线，如下所示：发酵液酶活测定•发酵液离心处理：8000r,5min•取1mL上清液+5mL1%淀粉溶液于37度水浴5min沸水浴5min（使酶失活）• •去上述处理液1mL+DNS试剂2mL沸水浴，取出后迅速冷却+9mL蒸馏水，摇匀•600nm波长处测其吸光值•上清液+1%淀粉溶液直接加热煮沸+DNS试剂（空白）发酵时间/h发酵液OD值（540nm）葡萄糖含量/mg酶活u/mL2.50.0210.054160.361074.50.0190.049150.32767DNS法测发酵液酶活结果淀粉酶的酶活单位（淀粉酶的酶活单位（u）：在）：在37℃℃下，每分钟生成下，每分钟生成1umol葡葡萄糖所用的酶量为一个酶活单位萄糖所用的酶量为一个酶活单位【【1umol/min】】公式：样品葡萄糖含量公式：样品葡萄糖含量X6X103÷180÷5出料•发酵到一定阶段，要及时结束发酵。

•打开底阀和放料阀，使发酵液通过放料管放出•结束发酵实训感想•我最我最想说：只学习是不行的，实践能力很重要实训两周想说：只学习是不行的，实践能力很重要实训两周流量和电量都好省哦！流量和电量都好省哦！•荀祺绚最想说：身体的疲惫荀祺绚最想说：身体的疲惫 ，劳动的汗水，劳动的汗水 ，但是尝到苦，但是尝到苦尽甘来的滋味尽甘来的滋味•徐会舟最想说：实训充满着好奇与辛酸，总体感觉不错徐会舟最想说：实训充满着好奇与辛酸，总体感觉不错•耿丹最想说：实训虽然挺累的，但高兴地是从中学到了许耿丹最想说：实训虽然挺累的，但高兴地是从中学到了许多课堂上学不到的知识多课堂上学不到的知识•赵娜最想说：实训两周过的好快呀！赵娜最想说：实训两周过的好快呀！•朱素玉最想说：培养基味好臭啊！朱素玉最想说：培养基味好臭啊！•张琪最想说：实训太给力了，不用上晚自习太好了！张琪最想说：实训太给力了，不用上晚自习太好了！•贾宇凡最想说：实训两周累死喃了！贾宇凡最想说：实训两周累死喃了！ 总结：实训了两周，我们组合作愉快，充分体现了团队精总结：实训了两周，我们组合作愉快，充分体现了团队精神，第五组是最棒的！！！神，第五组是最棒的！！！。