载体构建程序.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑载体构建程序 载体构建一般程序 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 提取拟南芥叶片DNA 设计引物 获得目的基因片段 特定的限制性内切酶酶切 基因片段连接入质粒 连接产物转化进感受态细胞中 摇菌，PCR检测插入基因 测序 各步的概括内容： 1、 提取拟南芥叶片DNA：Mini-scale genomic DNA extraction from Arabidopsis leaves，野生型拟南芥的叶片的DNA 2、 设计引物：对于用于普遍的PCR的基因的引物设计，要符合以下几个条件： （1）引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性 （2）产物不能形成二级布局 （3）引物长度一般在15~30碱基之间 （4）G+C含量在40%~60%之间 （5）碱基要随机分布 （6）引物自身不能有连续4个碱基的互补 （7）引物之间不能有连续4个碱基的互补 （8）引物5′端可以修饰 （9）引物3′端不成修饰 （10）引物3′端要避开密码子的第3位 假设要用于酶切的基因，除了得志以上的条件外，首先需选择适合的限制性内切酶，需要得志：（1）所要连接的质粒上有该酶切单克隆位点；（2）目的基因中没有该酶切位点；（3）在基因本身的引物5’端加上所选酶切位点识别碱基序列；（4）根据处境在引物5’端或3’端加上养护碱基，一般只在5’端加养护碱基就行了。

3、 获得目的基因：使用高保真酶Prime STAR HS DNA Polymerase,以提取的WT DNA为模板做PCR，获得所需目的基因片段 回响体系： 5*prime STAR Buffer (Mg2+ plus) 10ul dNTP Mixture (各2.5mM) 4ul 引物1（10uM） 1ul 引物2（10uM） 1ul 模板DNA（WT） 2ul Prime STAR HS DNA Polymerase（2.5u/ul） 0.5ul 灭菌水 up to 50ul (31.5ul) 回响程序：94℃ 4min; 98℃ 20s; 55℃ 30s; 35 cycles 72℃ 70s; 72℃ 10min; 12℃ ----- PCR回响终止后取全体回响液举行琼脂糖凝胶电泳，之后举行胶回收。

回收产物用不少于30ul的灭菌水溶解后，取5ul电泳检测回收片段 胶回收：使用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，其步骤为： 1、 从琼脂糖凝胶中割下含目标片段的胶块，称重； 2、 参与胶块重量的4倍的Buffer B2，50℃水浴5-10min溶胶； 3、 将溶胶液移入吸附柱中，可室温静置2-5min，8000g离心30秒，倒掉收集管中的液体； 4、 参与500ul Wash Solution，9000g离心30秒，倒掉收集管中的液体； 5、 重复步骤4一次； 6、 空吸附柱于9000g离心1分钟，开盖晾5min； 7、 将吸附柱放入一个明净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央参与60℃预热的灭菌水不少于30ul，室温静置2min，9000g离心1min，保存管中DNA溶液 4、特定的限制性内切酶酶切：要获得重组载体，首先要对获得的目的基因和所要转入的质粒用一致的限制性内切酶酶切，产生一致的粘性末端，便于连接选择适合的限制性内切酶，在适合的条件下回响，一般回响4小时左右 对于双酶切体系，酶切缓冲液的选择可以参照宝生物工程公司的限制酶中双酶切回响时通用缓冲液手册来选择适合的缓冲液及其回响浓度。

不同的限制酶有不同的最适回响温度，有30℃和37℃两种，假设所选的两种限制酶的最适回响温度不一样，可以先在30℃中回响2.5h，后转入37℃中回响1.5h即可 酶切回响终止后，举行琼脂糖凝胶电泳检测，切下含有目的基因条带的胶块做胶回收，步骤同上 5、 基因片段连接入质粒：目的基因和载体经过酶切处理，既有一致的粘性末端，在连接酶的作用下，可以连接在一起形成重组质粒通常使用的连接酶是TaKaRa公司的T4 DNA 连接酶其回响体系为： 10*T4 DNA Ligase Buffer 2.5ul DNA 片段* 约0.3pmol 载体DNA** 约0.03pmol T4 DNA Ligase 1ul 灭菌水 up to 25ul *DNA片段的摩尔数应操纵在载体DNA摩尔数的3-10倍 **平滑末端的载体与DNA片段举行连接时，应首先将载体举行去磷酸化处理，以防止其自身环化。

16℃过夜回响 若Buffer展现少量沉淀属正常现象，可在37℃保温溶解后使用 6、 连接产物转化进感受态细胞中： 感受态细胞的制备：以大肠杆菌DH5a细胞为例 1、．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜（约12h） 2、取0.5ml 过夜培养液，接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2h （注：以下操作均应在冰浴中举行 3、将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10min，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30min 4、4℃离心,4000g×10min，弃去上清，参与冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮 5、以50ul/管分装入1.5ml离心管中，-80℃保存备用 转化：连接产物转化进大肠杆菌DH5a感受态细胞中 1、 崭新制备的或-80℃下保存的50uL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞平匀悬浮 2、 参与10ul连接产物到50ul感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。

3、 42℃热激90s（不超过90s），期间勿摇动 4、 冰浴2-5min，而后参与450ul LB液体培养基（不含抗生素） 5、 37℃，220rpm，培养40min 6、 6000g离心2min，吸去片面上清，留下大约70-100ul，涂布到LB固体培养基（含相应抗生素）平板上，平匀涂布 7、 倒扣平板，37℃培养16-18h 7、 摇菌，PCR检测插入基因：待平板长出菌落后，用小枪头挑取白色的单菌落于装有3ml LB液体培养基（含相应抗生素）的试管中，37℃，220rpm，培养24h PCR检测：取200ul培养液做PCR，可以用普遍的rTaq酶，引物为扩增目的基因的引物 质粒DNA的提取：PCR检测出目的基因后，可将该对应管中的菌液的质粒提取出来，举行检测，就可得到重组质粒质粒DNA的提取根据碱裂解法原理使用试剂盒按照步骤举行操作提取其步骤为： 1、 取1-4ml在LB培养基中培养过夜的菌液（按照菌液浓度不同可适当变更参与的菌液量），12000g离心1min，弃尽上清 2、 加250ul Buffer S1（确认Buffer S1中已参与RNase A），悬浮细菌沉淀，强烈震荡，不应留有小的菌块。

3、 加250ul Buffer S2，立刻温柔并充分地上下颠倒翻转 4-6次混合平匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液此步骤不宜超过5min 4、 加350ul Buffer S3，立刻温柔并充分地上下翻转混合6-8次，12000g离心10min步骤3和4在冰上操作效果更佳 5、 吸取上清并转移到制备管（2ml）中，室温放置2min，12000g离心1min，弃滤液 6、 将制备管置回离心管，加500ul Buffer W1，12000g离心1min，弃滤液 7、 将制备管置回离心管，加700ul Buffer W2，12000g离心1min，弃滤液； 以同样的方法再用700ul Buffer W2洗涤一次，弃滤液参与前确保Buffer W2已按试剂瓶上的指定体积参与无水乙醇） 8、 将制备管置回2ml离心管中，12000g离心1min开盖室温放置5-10min，使残留的乙醇彻底挥发 9、 将制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加60-80ul去离子水，室温静置2min，12000g离心1min将去离子水加热至65℃将提高洗脱效率） 8、测序：将检测出目的基因片段的菌液和质粒送去测序，可以鉴定目的基因是否插入告成。

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