DNA重组的的基本操作.ppt

第三章第三章 DNADNA重组的基本操作重组的基本操作  一、核酸的分离提取一、核酸的分离提取 二、电泳技术二、电泳技术 三、外源三、外源DNADNA片段的制备片段的制备 四、转化方法四、转化方法 五、重组克隆的挑选五、重组克隆的挑选一、核酸的分离提取一、核酸的分离提取( (isolate)isolate) （一）、（一）、DNADNA的提取的提取一般原理：一般原理：细胞分散：细胞分散：动物组织采用匀浆法；植物组织材料动物组织采用匀浆法；植物组织材料采用液氮法；微生物材料收集细胞，采用离心法采用液氮法；微生物材料收集细胞，采用离心法细胞破碎：细胞破碎：对于动物材料，直接加入去污剂（多对于动物材料，直接加入去污剂（多位位SDS),SDS),有细胞壁结构的细胞，用分解细胞壁的有细胞壁结构的细胞，用分解细胞壁的酶处理，如溶菌酶处理大肠杆菌；用纤维素酶处酶处理，如溶菌酶处理大肠杆菌；用纤维素酶处理植物细胞等然后用去污剂处理使细胞膜破裂，理植物细胞等然后用去污剂处理使细胞膜破裂，原生质体释放原生质体释放去除蛋白：去除蛋白：蛋白酶蛋白酶K K处理；酚处理；酚/ /氯仿抽提。

氯仿抽提 去除去除RNA:RNA: RNaseRNase 处理核酸沉淀：核酸沉淀：乙醇沉淀；异丙醇沉淀乙醇沉淀；异丙醇沉淀溶解：溶解：1 1XTE XTE 溶解溶解定性分析：定性分析：电泳分析，根据标准分子量标准确定电泳分析，根据标准分子量标准确定大小、纯度（有无大小、纯度（有无RNARNA））定量分析：定量分析：电泳，以标准含量的电泳，以标准含量的DNADNA确定浓度；确定浓度；紫外测定紫外测定OD260OD260质量：质量：OD280/OD260.OD280/OD260.DNADNA提取操作实例：提取操作实例：质粒DNA的提取 碱裂解法碱裂解法溶液溶液1－－GET缓冲液：缓冲液： 50mmol/L葡萄糖，葡萄糖， 10mmol/L EDTA，，20mmol/L 20mMTris-HCl pH8.0，， 100 g/ml RNas A 4oC 保存溶液溶液2－－0.2mol/L NaOH, 1%SDS溶液溶液3－乙酸钾溶液－乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)：： 60mL的的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，冰醋酸， 28.5mL H2OTE缓冲液缓冲液: 10mmol/L，，Tris-HCl, 1mmol/L，，EDTA ，， pH8.0, 100%乙醇，乙醇，70％乙醇％乙醇1.1.质粒扩增质粒扩增1.1.1.1.从从AmpAmp抗抗性性培培养养的的培培养养平平板板上上挑挑取取生生长长状状态态好好的的单单菌菌落落，，置置于于4 4mlml的的100100ugug/ml/ml的的AmpAmp——LBLB液液体体培培养养基基中中，，3737℃℃，，120120rpmrpm空空气气摇摇床床培培养养4-54-5小小时时，，待培养物约为对数生长期，用于扩大培养。

待培养物约为对数生长期，用于扩大培养1.21.2取取500500mlml离离心心瓶瓶，，含含有有200200mlml的的LBLB培培养养基基（（LBLB培培养养基基配配置置见见试试剂剂配配制制）），，将过夜培养物，以备质粒提取将过夜培养物，以备质粒提取2.2.质粒提取质粒提取2.1.2.1.取取250250mlml离离心心瓶瓶，，将将过过夜夜培培养养物物（（200200mlml菌菌液液））倒倒于于离离心心瓶瓶中中，，40004000rpmrpm，，4℃4℃，，离心离心1515分钟2.2.2.2.上上清清液液小小心心转转入入废废液液杯杯中中，，沉沉淀淀为为菌菌体体将将沉沉淀淀打打散散，，加加入入4 4mlml质质粒粒提取液提取液I I，，室温放置室温放置5 5分钟2.3.2.3.将将所所有有液液体体倒倒入入5050mlml离离心心管管中中（（以以下下操操作作都都在在5050mlml离离心心管管中中进进行行）），，加加入入质质粒粒提提取取液液II II 8ml8ml，，混混合合后后于于室室温温放放置置5 5分分钟钟加加质质粒粒提提取取液液III6mlIII6ml，，混匀，可见白色沉淀，冰上放置混匀，可见白色沉淀，冰上放置1515分钟。

分钟2.4. 2.4. 1000010000rpmrpm，，4℃4℃，，离离心心1515分分钟钟，，取取液液相相加加入入等等体体积积的的异异丙丙醇醇混混合合，，－－20℃20℃放置放置1515分钟2.5.100002.5.10000rpmrpm离离心心,4℃,4℃，，1515分分钟钟, ,去去上上清清，，沉沉淀淀用用5 5ml ml 1×TE1×TE溶溶解解后后，，加加5 5ml ml 5M5M LiClLiCl混匀，混匀，1000010000rpmrpm，，4℃4℃离心离心2020分钟2.6.2.6.取取上上清清，，加加入入等等体体积积异异丙丙醇醇沉沉淀淀，，1000010000rpmrpm离离心心1515分分钟钟沉沉淀淀加加入入500500μl μl 1×TE1×TE溶溶液液将将所所得得溶溶液液吸吸入入1.51.5mlml离离心心管管中中再再加加入入3 3μμlRNAlRNA酶酶，，37℃37℃放放置置2 2小小时（以下操作均在时（以下操作均在1.51.5mlml离心管中进行）离心管中进行）2.7.2.7.加加入入等等体体积积聚聚乙乙二二醇醇溶溶液液12000 12000 rpmrpm离离心心1010分分钟钟，，收收集集沉沉淀淀。

沉沉淀淀用用400400μl 1×TEμl 1×TE溶解2.8.2.8.加加入入400400μlμl饱饱和和酚酚，，混混匀匀，，12000 12000 rpmrpm，，离离心心3 3分分钟钟，，取取上上清清至至新新的的1.51.5mlml离离心管内加入加入200200μlμl饱和酚＋饱和酚＋200200μlμl氯仿，混匀，氯仿，混匀，12000 12000 rpmrpm，，离心离心3 3分钟，取上清至新分钟，取上清至新的的1.51.5mlml离心管内离心管内加入加入400400μlμl氯仿，混匀，氯仿，混匀，12000 12000 rpmrpm，，离心离心3 3分钟取水相至分钟取水相至新的新的1.51.5mlml离心管内离心管内2.9.2.9.加加入入3535ulul 3mol/L,3mol/L,然然后后加加NaACNaAC,700μl,700μl乙乙醇醇沉沉淀淀混混匀匀，，室室温温放放置置1010分分钟钟后后，，于于4℃4℃，，12000 12000 rpmrpm，，离心离心5 5分钟，取沉淀分钟，取沉淀2.10.2.10.加入加入200200μl 80%μl 80%乙醇洗盐。

置于乙醇洗盐置于37℃37℃烘干2.11.2.11.用用100100μl×TEμl×TE溶解沉淀溶解沉淀3.3.检测检测3.13.1电泳检测电泳检测3.1.1.3.1.1.配配制制0.80.8％％的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶称称取取琼琼脂脂糖糖0.240.24g,g,置置于于100100mlml的的三三角角瓶瓶中中，，加加电电泳缓冲液泳缓冲液3030ml, ml, 放于水平的桌子上，在三角瓶的水位线处作以标记放于水平的桌子上，在三角瓶的水位线处作以标记3.1.2.3.1.2.用用牛牛皮皮纸纸包包瓶瓶口口，，于于微微波波炉炉中中加加热热至至琼琼脂脂融融化化，，取取出出，，放放于于水水平平的的桌桌子子上上，，用蒸馏水补充到三角瓶的标记处冷至用蒸馏水补充到三角瓶的标记处冷至60℃60℃时，加溴化乙锭时，加溴化乙锭0.005%0.005%3.1.3.3.1.3.在在煮煮凝凝胶胶的的同同时时，，准准备备干干净净的的可可盛盛胶胶3030mlml的的铸铸胶胶托托盘盘一一个个，，用用透透明明胶胶带带封封两边的口至于水平桌面上，放上两边的口至于水平桌面上，放上1 1mmmm厚，厚，5 5mmmm宽的梳子宽的梳子。

3.1.4.3.1.4.将凝胶倒入托盘中，自然冷却将凝胶倒入托盘中，自然冷却3.1.5.3.1.5.上样上样1 1ulul，，15cm/100V15cm/100V电泳电泳1 1小时3.1.6. 3.1.6. 观察观察RNARNA和核和核DNADNA是否除净是否除净RNARNA片段较小，跑在最前面；核片段较小，跑在最前面；核DNADNA片段很片段很大，位于胶孔跑不出来）如果核大，位于胶孔跑不出来）如果核DNADNA的亮度强于质粒条带，质粒提取不合格，的亮度强于质粒条带，质粒提取不合格，重新抽提重新抽提3.23.2．．ODOD值的测定值的测定2.2.1.2.2.1.取取石石英英比比色色杯杯一一支支，，加加3 3mlml蒸蒸馏馏水水，，加加入入DNADNA溶溶液液1010ulul用用紫紫外外分分光光光光度度计计测测ODOD260260和和O.DO.D2802802.2.22.2.2计算公式计算公式: : DNADNA含量（含量（ugug/ /ulul））=50XO.D=50XO.D260260X3/10X3/101.培培养养细细菌菌：：将将带带有有质质粒粒的的大大肠肠杆杆菌菌接接种种到液体培养基，到液体培养基，37℃培养培养12～～16小时小时;2.取取液液体体培培养养液液1.5-3ml于于Eppendorf管管中中，，10000r/min离离心心1min，，去去掉掉上上清清液液，，加加入入100 l溶液溶液1 ，充分混匀，充分混匀;3.加加入入200 l新新配配制制的的0.2mol/L NaOH(内内含含1％％SDS)，，加加盖盖颠颠倒倒6-7次次使使之之混混匀匀，，冰上放置冰上放置5min;质粒小量提取的方法：质粒小量提取的方法：4.加入加入150   l乙酸钾溶液乙酸钾溶液(pH4.8)，，加盖后颠倒加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置次混匀，冰上放置5－－15min;5.用台式高速离心机，用台式高速离心机，10000r/min离心离心7min，，上上清移入另一干净离心管，并加清移入另一干净离心管，并加1ml 100％％乙醇混乙醇混匀，匀，12000r/min离心离心5min，，弃去上清液弃去上清液;6.沉淀用沉淀用70％乙醇清洗一次，小管倒置于吸水纸％乙醇清洗一次，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥上，除尽乙醇，室温自然干燥;7.加入加入30-50 l灭菌蒸馏水或灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取缓冲液溶解提取物，室温放置物，室温放置15-30min，，使使DNA充分溶解充分溶解(有时有时需要酚需要酚:氯仿抽提氯仿抽提);8.将分离出的质粒将分离出的质粒DNA置于置于-20℃保存备用。

保存备用WizardTM Plus Minipreps DNAPurification System (Promega)This purification system is silica membrane-based and modified alkaline lysis procedure based system, which specifically absorbs DNA in the presence of high concentration of some salt. Proteins and other impurities are not absorbed and will be removed. DNA can be eluted under low-salt condition or water. The yield of plasmid DNA will vary depending on a number of factors. • Cell Resuspension Solution 50mM Tris-HCl (pH 7.5) 10mM EDT 100µg/ml RNase A• Cell Lysis Solution 0.2M NaOH 1% SDS• Neutralization Solution 1.32M potassium acetate (pH 4.8)• Column Wash Solution 80mM potassium acetate 8.3mM Tris-HCl (pH 7.5) 40µM EDTA 55% ethanol • TE buffer (1X) 10mM Tris-HCl (pH 7.5) 1mM EDTA注意：注意： •用移液器（俗称用移液器（俗称“枪枪”）操作时，）操作时，每一步都要格外小心，以免切碎每一步都要格外小心，以免切碎DNA(DNA(包括质粒包括质粒DNADNA和基因组和基因组DNA);DNA);•加入溶液加入溶液II II 和和IIIIII后，一定不要后，一定不要剧烈振荡，避免导致基因组剧烈振荡，避免导致基因组DNADNA的的断裂而污染质粒断裂而污染质粒DNADNA！！！！！！1.Pellet 1–3ml of cells by centrifugation for 1–2 minutes at 10,000 × g in a microcentrifuge. Pour off the supernatant and blot the tube upside-down on a paper towel to remove excess media.2.Completely resuspend the cell pellet in 200µl of Cell Resuspension Solution (Solution I））. 3.Add 200µl of Cell Lysis Solution (Solution II) and mix by inverting the tube 4 times. The cell suspension should clear immediately.4.Add 200µl of Neutralization Solution (Solution III)and mix by inverting the tube 4 times.5.Centrifuge the lysate at 10,000 × g in a microcentrifuge for 10minutes.6. Pipet 1ml of the resuspended resin into each barrel of the Minicolumn/syringe assembly. (If crystals or aggregates are present, dissolve by warming the resin to 25–37°C for 10 minutes. Cool to 30°C before use.)7.Carefully remove all of the cleared lysate from each miniprep and transfer it to the barrel of the Minicolumn/syringe assembly containing the resin. No mixing is required.8.Carefully insert the syringe plunger and gently push the slurry into the minicolumn.9.Detach the syringe from the Minicolumn and remove the plunger from the syringe barrel. Reattach the syringe barrel to the Minicolumn.10.Pipet 2ml of Column Wash Solution (after the addition of ethanol) into the barrel of the Minicolumn/syringe assembly. Insert the plunger into the syringe and gently push the Column Wash Solution through the Minicolumn.11.Remove the syringe and transfer the Minicolumn to a 1.5ml microcentrifuge tube. Centrifuge the Minicolumn at 10,000 × g in a microcentrifuge for 2 minutes to dry the resin.12.Transfer the Minicolumn to a new 1.5ml microcentrifuge tube. Add 50µl of nuclease-free water to the Minicolumn and wait 1 minute. Centrifuge at 10,000 × g in a microcentrifuge for 20 seconds to elute the DNA. The DNA will remain intact on the Minicolumn for up to 30 minutes; however, prompt elution will minimize nicking of plasmids in the range of 20kb.13.Remove and discard the Minicolumn. Follow these storage recommendations: DNA is stable in water without addition of a buffer if stored at –20°C or below. DNA is stable at 4°C in TE buffer. To store the DNA in TE buffer, add 5µl of 10X TE buffer to the 50µl of eluted DNA.B. 用分光光度计法定量用分光光度计法定量DNA1.取取2 l提提取取的的质质粒粒DNA，，加加入入98 l蒸蒸馏馏水水对对待待测测DNA样样品品做做1:50(或或更更高高倍数的稀释倍数的稀释);2.蒸蒸馏馏水水作作为为空空白白,在在波波长长260nm、、280nm处处调调节节紫紫外外分分光光光光度度计计读读数数至零。

至零3.加加 入入 DNA稀稀 释释 液液 ，， 测测 定定 260nm 及及280nm的的吸吸收收值值260nm 读读数数用用于于计计算算样样品品中中核核酸酸的的浓浓度度，，OD260值值为为1相相当当于于约约50 g /ml双双链链DNA，，33 g /ml单单链链可可根根据据在在260nm以以及及在在280nm的的读读数数的的比比值值（（OD260/OD280））估估计计核核酸酸的的纯纯度度一一般般DNA的的纯纯品品，，其其比比值值为为1.8，，低低于于此此值值说说明明有有蛋蛋白白质质或或其其它它杂杂质质的污染4.记录记录OD值，通过计算确定值，通过计算确定DNA浓浓度或纯度，公式如下度或纯度，公式如下: dsDNA=50×(OD260) × 稀释倍数稀释倍数以上浓度单位为以上浓度单位为 g /ml植物总植物总DNADNA提取提取1.植物总植物总DNA提取原理及方法概述提取原理及方法概述（（1））CTAB法法原理：原理：CTAB（（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl））是可溶的，当降是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（低溶液盐浓度到一定程度（ 0.3mol/L NaCl ））时，时，从溶液中沉淀，通过离心就可将从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开。

然后将合物同蛋白质、多糖类物质分开然后将CTAB与与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，使核酸沉淀， CTAB能溶于乙醇能溶于乙醇方法：方法：1.1.取取1-501-50克新鲜植物材料，于液氮中研磨成粉克新鲜植物材料，于液氮中研磨成粉2.2.将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入等体将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入等体积（积（w/vw/v））65 ℃65 ℃预热的预热的2 2 x CTABx CTAB提取缓冲液，提取缓冲液，充分混匀，充分混匀， 65 ℃65 ℃保温保温10-2010-20分钟，其间不时摇分钟，其间不时摇动3.3.加入等体积的氯仿加入等体积的氯仿/ /异戊醇，轻缓颠倒离心管异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下混匀，室温下1200012000rpmrpm离心离心10-2010-20分钟4.4.将上清转入另一离心管中，假如将上清转入另一离心管中，假如1/101/10体积的体积的10%10%CTABCTAB，，混匀，加入等体积的氯仿混匀，加入等体积的氯仿/ /异戊醇，颠倒离异戊醇，颠倒离心管混匀，室温下心管混匀，室温下1200012000rpmrpm离心离心10-2010-20分钟。

分钟5.5.取上相，重复取上相，重复4 4操作一次操作一次6.6.将上相转入新的离心管，加入将上相转入新的离心管，加入1-1.51-1.5倍体积的倍体积的1 1x x CTABCTAB沉淀缓冲液，混匀，室温下放置沉淀缓冲液，混匀，室温下放置3030分钟，沉淀分钟，沉淀 7.3500-40007.3500-4000rpmrpm离心离心5-105-10分钟，去上清分钟，去上清 ，沉淀吹，沉淀吹干8.8.按按0.50.5ml/gml/g材料的比例加入材料的比例加入1 1mol/Lmol/L乙酸铵溶液，乙酸铵溶液，使沉淀溶解完全，再加入使沉淀溶解完全，再加入7.57.5mol/Lmol/L乙酸铵至终乙酸铵至终浓度为浓度为2.52.5mol/L.mol/L.9.9.加入加入2 2倍体积的异戊醇，混匀，室温下放置倍体积的异戊醇，混匀，室温下放置1010分分钟10. 1000010. 10000rpmrpm离心离心5 5分钟，去上清分钟，去上清11.11.用用70%70%乙醇漂洗沉淀，吹干，沉淀溶于适量乙醇漂洗沉淀，吹干，沉淀溶于适量TETE优点：优点： 能很好的去除糖类杂质，对于含糖较高的材能很好的去除糖类杂质，对于含糖较高的材料可优先采用。

料可优先采用（（2））SDS法法原理：原理： 利用高浓度的利用高浓度的SDSSDS，，在较高温度（在较高温度（55-65 ℃ 55-65 ℃ ）条）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀（最常用的是加入质及多糖杂质沉淀（最常用的是加入5 5mol/L mol/L 的的KACKAC于于冰上保温，低温条件下冰上保温，低温条件下KAC KAC 与蛋白质及多糖结合成不与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清中的溶物），离心除去沉淀后，上清中的DNADNA反复用酚反复用酚/ /氯氯仿抽提，用乙醇沉淀水相中的仿抽提，用乙醇沉淀水相中的DNADNA（（3）植物总）植物总DNA提取时常遇到的问题提取时常遇到的问题1.1.植物材料中含有较多的多酚类物质，使植物材料中含有较多的多酚类物质，使DNADNA呈褐色解决办法：解决办法：提高提高CTABCTAB提取缓冲液中巯基乙醇的含量提取缓冲液中巯基乙醇的含量或在或在SDSSDS提取液中加入提取液中加入6%6%的的PVPPVP（（聚乙烯吡咯烷酮）。

聚乙烯吡咯烷酮）2.2.植物细胞壁难以破碎植物细胞壁难以破碎解决办法：解决办法：在在SDSSDS提取液中加入蛋白酶提取液中加入蛋白酶K K，，在液氮冷在液氮冷冻条件下研磨冻条件下研磨植物植物DNADNA样品纯度及浓度的鉴定样品纯度及浓度的鉴定 用于用于SouthernSouthern杂交的植物杂交的植物DNADNA样品样品在纯度、长度及浓度上均有较高的要求在纯度、长度及浓度上均有较高的要求纯度上应无蛋白质、纯度上应无蛋白质、RNARNA、、多糖及抑制限多糖及抑制限制性内切酶活性的物质；在长度上不应低制性内切酶活性的物质；在长度上不应低于于5050kbkb；；浓度应在浓度应在0.5-1 0.5-1 μg/ μlμg/ μl之间目前主要采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光目前主要采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法进行检测光度法进行检测（（1 1）琼脂糖凝胶电泳）琼脂糖凝胶电泳 1.1.所提植物所提植物DNADNA应呈现出一条分子量较大的清应呈现出一条分子量较大的清晰条带如样品呈弥散状，说明晰条带如样品呈弥散状，说明DNADNA已严重降解，已严重降解，可能原因是：所用的器皿及试剂是否灭菌；材可能原因是：所用的器皿及试剂是否灭菌；材料收集后是否立即冷冻，研碎过程中或研碎后料收集后是否立即冷冻，研碎过程中或研碎后进入提取液前是否融化；是否有剧烈振动、吸进入提取液前是否融化；是否有剧烈振动、吸管口过窄、产生起泡、反复吹打等操作。

管口过窄、产生起泡、反复吹打等操作 2.2.如在溴酚兰处出现明亮的荧光区，说明如在溴酚兰处出现明亮的荧光区，说明RNARNA过多，可用过多，可用RNARNA酶消化 3.3.如在样品槽内有荧光出现，说明如在样品槽内有荧光出现，说明DNADNA未完全未完全溶解或浓度过高，或样品不纯溶解或浓度过高，或样品不纯4.4.估算样品的浓度估算样品的浓度（２）紫外分光光度法测定（２）紫外分光光度法测定1.1.纯度：纯度： 纯净的纯净的DNADNA溶液其溶液其ODOD260260／／ODOD280280应为应为1.81.8，， ODOD260260／／ODOD230230应大于应大于2.02.0 如果如果ODOD260260／／ODOD280280大于大于1.81.8，表明应中含有较多的，表明应中含有较多的RNARNA；；如果如果ODOD260260／／ODOD280280小于小于1.61.6，则说明样品中蛋白质较多；，则说明样品中蛋白质较多； ODOD260260／／ODOD230230小于小于2.02.0时，表明溶液中有残存的小时，表明溶液中有残存的小分子及盐类杂质，可增加分子及盐类杂质，可增加70%70%乙醇洗涤沉淀的次乙醇洗涤沉淀的次数。

数2.2.浓度：浓度：DNADNA样品浓度（样品浓度（ μg/ μlμg/ μl ））= OD= OD260260××稀释倍数稀释倍数×0.05×0.05■■制品说明制品说明本试剂盒用于从血液中提取本试剂盒用于从血液中提取DNADNA通常这种操作非常复杂通常这种操作非常复杂, , 而使而使用本试剂盒既可以在短时间内完成用本试剂盒既可以在短时间内完成 (40(40分钟分钟) ) 全部操作全部操作, , 又可又可以获得高纯度的以获得高纯度的DNADNA该该DNADNA可用于包括可用于包括TaKaRaTaKaRa LA PCR LA PCR技术在内技术在内的的PCRPCR反应和限制酶酶切等实验本试剂盒既适用于刚采尚未凝反应和限制酶酶切等实验本试剂盒既适用于刚采尚未凝固的全血固的全血, ,又适用于经各种抗凝剂又适用于经各种抗凝剂 ( (柠檬酸、柠檬酸、EDTAEDTA、、肝素肝素) ) 处理处理过的全血过的全血■■原理原理本试剂盒由本试剂盒由GenTLEGenTLE Solution I Solution I、、IIII、、III III 三部分组成，其中三部分组成，其中GenTLEGenTLE Solution I Solution I 的作用是在破坏血细胞的同时，与核酸形的作用是在破坏血细胞的同时，与核酸形成电中性的复合体，将该复合体离心收集并用成电中性的复合体，将该复合体离心收集并用GenTLEGenTLE Solution Solution II II 清洗后，在沉淀中加入清洗后，在沉淀中加入GenTLEGenTLE Solution III Solution III，，将将DNADNA分离出分离出来，再加入异丙醇将来，再加入异丙醇将DNADNA沉淀回收。

由于沉淀回收由于GenTLEGenTLE Solution I Solution I 具具有破坏菌体和病毒粒子的作用，这对于处理那些有可能发生病有破坏菌体和病毒粒子的作用，这对于处理那些有可能发生病原菌等污染的样品非常有利，而且原菌等污染的样品非常有利，而且GenTLEGenTLE Solution I Solution I 与核酸与核酸生成的复合体牢固、稳定，便于样品的运输以及大量样品的处生成的复合体牢固、稳定，便于样品的运输以及大量样品的处理宝）大连生物工程公司的（宝）大连生物工程公司的DNADNA提取产品提取产品LaneM:λ-EcoT14 I digest Marker (250 ng)1:柠檬酸处理血提取DNA2:EDTA处理血提取DNA3:肝素处理血提取DNABio-Bio-RadRad 公司的一个提取产品公司的一个提取产品 ————————DNADNA提取试剂盒提取试剂盒（二）（二）RNARNA的提取的提取 RNARNA的提取过程基本与的提取过程基本与DNADNA的提取过程相似，同的提取过程相似，同样有破细胞，除蛋白，沉淀回收样有破细胞，除蛋白，沉淀回收RNARNA样品等过程，其样品等过程，其基本原理也基本一致。

所不同的是：由于基本原理也基本一致所不同的是：由于RNaseRNase很稳很稳定，所以在定，所以在RNARNA提取中特别注意的是防止提取中特别注意的是防止RNaseRNase的污的污染，导致染，导致RNARNA别降解通常用别降解通常用1%1%的的DEPCDEPC（（二乙基焦炭二乙基焦炭酸）溶液处理用具但这样也不能保证彻底灭活酸）溶液处理用具但这样也不能保证彻底灭活RNaseRNase，，所以最好的办法是所有离心管，吸头等用品所以最好的办法是所有离心管，吸头等用品都一次性使用，操作时要戴上手套避免操作者将都一次性使用，操作时要戴上手套避免操作者将RNaseRNase带入样品中去带入样品中去  RNARNA提取方法很多，但基本上是采用提取方法很多，但基本上是采用酸性盐酸胍酸性盐酸胍————酚酚/ /氯仿一步法的基础上氯仿一步法的基础上进行改进的该方法的原理是：进行改进的该方法的原理是： 1.1.用胍盐、用胍盐、SDSSDS裂解细胞，灭活裂解细胞，灭活RNaseRNase和核蛋白，用酚和核蛋白，用酚/ /氯仿除蛋白；氯仿除蛋白； 2.2.由于在酸性条件下，由于在酸性条件下，DNADNA不溶于水相，不溶于水相，RNARNA不溶于有机相，这样可以将不溶于有机相，这样可以将RNARNA和和DNADNA分开；分开； 3.3.然后用乙醇或异丙醇沉淀然后用乙醇或异丙醇沉淀RNARNA样品。

样品  细胞中的细胞中的RNARNA主要有主要有rRNArRNA、、tRNAtRNA和和mRNA.mRNA.一般将细胞分离的各种一般将细胞分离的各种RNARNA的总和的总和叫总叫总RNA,RNA,某些需要，要纯化某些需要，要纯化mRNA,mRNA,但多数但多数情况下，只要获得总情况下，只要获得总RNARNA就足够了就足够了 RNARNA用电泳检测是否完整，用紫外方用电泳检测是否完整，用紫外方法定量，用法定量，用ODOD260260/OD/OD280280确定其纯度，一般确定其纯度，一般要求要求OD260/OD280 >2.0RNARNA提取的一般操作程序：提取的一般操作程序： RNARNA提取试剂：提取试剂： 1.1.盐酸胍盐酸胍 8 8Mol/LMol/L 2.SDS 10% 2.SDS 10% 3. 3.巯基乙醇巯基乙醇 4. 4.NaAC 2Mol/L pH 4.0NaAC 2Mol/L pH 4.0 1.1.取取1 1g g动物组织于电动组织匀浆器中，加入动物组织于电动组织匀浆器中，加入8 8mlml试剂试剂1 1，，8080ulul试剂试剂2 2，，4040ulul试剂试剂3 3；； 2.2.开动电动组织匀浆器，均浆约开动电动组织匀浆器，均浆约2-32-3分钟，使组分钟，使组织充分磨碎；织充分磨碎； 3.3.将匀浆液转入一干净的将匀浆液转入一干净的5050mlml离心管中，加入离心管中，加入2 2mlml试剂试剂4 4，摇荡混匀；，摇荡混匀； 4.4.加入加入8 8mlml水饱和的重蒸酚水饱和的重蒸酚,2,2mlml含有五十分之一含有五十分之一异戊醇的氯仿，盖上离心管盖子，剧烈震荡异戊醇的氯仿，盖上离心管盖子，剧烈震荡1010分钟。

分钟 操作程序：操作程序： 5. 4 5. 4℃℃，，1200012000XgXg离心离心1515分钟，将上清液分钟，将上清液（含有（含有RNA)RNA)转入另一干净离心管中，注意不要转入另一干净离心管中，注意不要将两相间的沉淀搅混；将两相间的沉淀搅混； 6.6.向含有上清液的离心管中加入等体积的向含有上清液的离心管中加入等体积的冷异丙醇，盖上盖子，冷异丙醇，盖上盖子， 4 4℃℃，，1200012000XgXg离心离心1515分钟；分钟； 7. 7.去除上清，向沉淀中加入去除上清，向沉淀中加入2-32-3ml 75%ml 75%冷冷乙醇，洗涤沉淀，离心后（同步骤乙醇，洗涤沉淀，离心后（同步骤5 5）去上清，）去上清，沉淀再用沉淀再用75%75%冷乙醇，洗涤沉淀，离心后（同冷乙醇，洗涤沉淀，离心后（同步骤步骤5 5）去上清；）去上清； 8.8.向沉淀中加入向沉淀中加入500500ul ul 无无RNaseRNase 的纯水，的纯水，溶解沉淀，并转入一干净的溶解沉淀，并转入一干净的eppendorfeppendorf 离心管离心管中，中，-20℃-20℃长期保存。

长期保存用用QiagenQiagen RNeasyRNeasy提取试剂盒提取植物总提取试剂盒提取植物总RNARNA实验步骤实验步骤 （每一步均要求无（每一步均要求无RNaseRNase污染）污染）① ① 称取新鲜材料称取新鲜材料100 100 mgmg，，液氮速冻；液氮速冻；② ② 在预冷的研钵中并在液氮中将材料在预冷的研钵中并在液氮中将材料 研磨成细粉末，转移到研磨成细粉末，转移到2 2mlml或或1.51.5mlml 离心管中；离心管中；③ ③ 待液氮挥发（但不能解冻）后，加入待液氮挥发（但不能解冻）后，加入 450 450 μlμl提取缓冲液提取缓冲液RLTRLT，，混匀后在混匀后在 56℃56℃下温育下温育1 1～～3 3minmin；；④④ 将裂解液加到离心柱（淡紫色）上将裂解液加到离心柱（淡紫色）上 下接一个下接一个2ml收集管，最大转速离心收集管，最大转速离心 2min裂解液通过柱子时被均质化裂解液通过柱子时被均质化 小心吸取上清液，转移到另一新离小心吸取上清液，转移到另一新离 心管；心管；⑤⑤加入加入0.5倍体积（倍体积（225 μl））96～～100%⑥⑥ 乙醇，混合均匀。

加入乙醇后，可能乙醇，混合均匀加入乙醇后，可能⑦⑦ 会出现沉淀，无影响；会出现沉淀，无影响；⑥⑥将混合液全部（包括沉淀将混合液全部（包括沉淀675 675 μlμl））⑦⑦ 转转移移到到吸吸附附离离心心柱柱（（粉粉红红色色））内内，， 下下接接2 2 mlml的的收收集集管管，，10000 10000 rpmrpm离离心心 1515秒弃去管内液体；秒弃去管内液体；⑧⑧⑦⑦加加入入700700μl μl RW1RW1缓缓冲冲液液，，1000010000rpmrpm转速下离心转速下离心2525秒，弃去收集管；秒，弃去收集管；⑨⑨⑧⑧将将离离心心柱柱转转移移到到一一个个新新的的2 2mlml收收集集 管管上上，，加加入入500500μl μl RPERPE缓缓冲冲液液，， 10000 10000 rpmrpm离离心心1515秒秒，，弃弃去去管管内内液液体体 重复使用收集管；重复使用收集管；⑨⑨加加入入500μl RPE到到离离心心柱柱内内，，最最大大转转速速离心离心2min，，干燥离心柱，弃去收集管；干燥离心柱，弃去收集管；⑩⑩⑩⑩把把离离心心柱柱接接在在一一个个新新的的1.5 ml Eppen管管 上上 ，， 加加 入入 30～～ 50μl 无无 RNase水水（（0.1%DEPC处处理理）），，10000 rpm离离心心 1min，，洗洗出出RNA。

若若RNA产产量量在在20μg以以上上，，用用30～～50 μl无无RNase水水再再洗洗脱脱1次RNA样品保存于样品保存于-20℃备用1.1.凝胶制备（凝胶制备（1.21.2％）：用％）：用1ⅹ1ⅹ凝胶缓冲液配凝胶缓冲液配制制1.21.2％的凝胶，至少使其凝固％的凝胶，至少使其凝固3030分钟后分钟后进行上样；进行上样；2.2.样品制备：在离心管中，将样品制备：在离心管中，将RNARNA样品与样品与10ⅹ10ⅹ上样缓冲液以上样缓冲液以9:19:1比例混匀，迅速在比例混匀，迅速在冰上冷浴冰上冷浴5 5分钟，瞬时离心数秒分钟，瞬时离心数秒RNARNA上样上样量为量为2-302-30 g g，，本次本次实验为实验为1010 g g；；3.3.上样前凝胶须预电泳上样前凝胶须预电泳5 5minmin，，随后将样品加随后将样品加入加样孔，以入加样孔，以5 5V/cmV/cm的电压电泳的电压电泳1 1h h～～1.5h1.5h；；电泳检测电泳检测RNARNA：：  4. 4.待溴酚蓝迁移至凝胶待溴酚蓝迁移至凝胶长度的长度的4/54/5处结束电泳处结束电泳将凝胶置于溴化乙锭将凝胶置于溴化乙锭溶液中染色约溶液中染色约3030minmin；； 5. 5.在紫外灯下观察结果。

在紫外灯下观察结果上样孔28S rRNA23s叶绿体rRNA18s rRNA16s 叶绿体rRNAmRNA isolation•Only about 3% of total RNA is specific message (mRNA). Most is 28S and 18S•eg in 5mg of tissue about 10ug of RNA is present of which 0.3 ug is mRNA, a rare message accounts for 10fg-10pg in total, and a moderately abundant message 300pg•How can we isolate such small amounts of message?mRNA isolation•We utilise the feature of mRNA, ie the poly A tail•Using a column containing a synthetic oligonucleotide oligo(dT) attached•hybridise the mRNA to the oligo(dT) and wash away the remainder•Elute the mRNA by hot buffer•Usually we do two rounds of purification二、电泳技术二、电泳技术 electrophoresiselectrophoresis Definition•Electro = Charge + Phorsesis= Carry•Electrophoresis = Separation of charged molecules by differences in their rate of migration in an electric field.The Components of The System•Molecules to be separated–Proteins–Nucleic Acids•Support medium–Gel (Starch, Polyacrylamide or Agarose)•Buffer System–High Buffer Capacity•DC Power Source–50 – 1000 VCommon Support Media for Biological Molecules•Proteins–Native Gel (Acrylamide or Starch)–Denaturing (SDS) Gel (Acrylamide)•Nucleic Acids – DNA & RNA–Agarose Gel–Acrylamide GelDNA/Agarose Gel ElectrophoresisØHorizontal submarine electrophoresis most common; simplest separation by sizeØAgarose concentration 0.3-3%ØBuffer most often Tris-Borate-EDTA (TBE) at 1X or 0.5X; sometimes Tris-Acetate-EDTA (TAE) at 1X•Tris is the stronger bufferØDetection of DNA is generally by ethidium bromide intercalation (dye in gel, in buffer, in sample, or in immersion solution after run)AgaroseGood separation of all but smallest DNAs- mid-range to large pore size provides sieving effect; relatively inertLinear polysaccharide derived from seaweed extract; composed of repeating units of agarobioseWhen dissolved by heat in aqueous solution, then cooled, agarose solution gels due to formation of inter- and intra-chain H bonds=> The higher the concentration, the smaller the pore size 桥式水平电泳槽用于对用于对DNA、、蛋白的鉴定、分离、制备及蛋白的鉴定、分离、制备及分子量测定分子量测定 Preparing and running an agarose gelüSuspend agarose in running buffer (NOT H2O) to desired concentrationüHeat to boiling; once dissolved, cool to ~65oC; add EtBr if desired to 1 µg/ml; pour into gel tray with comb to form wells; let set completelyüPrepare DNA samples- add loading dye to 1X (provides high density to allow sample to sink, and provides dye for monitoring migration)üRemove comb from gel, set up in tank and submerge in bufferüLoad samples by pipetting slowly through buffer into wellsüAttach leads to tank and power supply; set V so I < 60 mARunning an agarose gel- agarose concentrationAgarose concentration needed is determined by sizes of DNA fragments to be separatedo for fragments between 0.5 and 3 kb, 0.7% is a good standard concentrationo to separate small fragments (0.2-0.7 kb) from one another, use 1.5-3% (smaller pore size)o for separation of larger fragments (>3 kb and less than 30 kb) use 0.3-0.5%Running an agarose gel- agarose concentrationè At low agarose concentrations, very little frictional resistance for small fragment => mobility is similar between different sizes; for high agarose concentrations, very little separation of large DNA fragments of different size because high frictional resistance for allè Separation of fragments above 20 kb is not ideal using any normal electrophoresis setupDetermining molecular size by determining electrophoretic mobilityDyes provide means of determining endpoint of run and of determining mobility, Mr and estimated size in kbBromophenol blue and Xylene cyanol are the most common agarose gel tracking dyes. In particular percentage agarose gel, dyes run with characteristic mobility; in general, BPB runs at 0.3-0.6 kb and xylene cyanol at 3-5 kbDetermining molecular size by determining electrophoretic mobility¬Mobility, Mr = distance migrated by band of interest/distance migrated by dye front¬Mr is related to logMW or log of molecular size in bp in linear fashion, therefore plot standards and can determine unknownsDetermining molecular size by determining electrophoretic mobilityDistance from origin, cmLog MW丙丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳泳•聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，可分为连续的和不连续的两类可分为连续的和不连续的两类 。

•前者指整个电泳系统中所用缓冲液，前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pHpH值值和凝胶网孔都是相同的；后者是指在电泳和凝胶网孔都是相同的；后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、pHpH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力 双垂直电泳槽•可用各种凝胶电泳，可同时做两块板 •在不连续在不连续PAGEPAGE系统里，存在三种物系统里，存在三种物理效应理效应, ,即电荷效应、分子筛效应和即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应浓缩效应•１、电荷效应：各种蛋白质按其所带电１、电荷效应：各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在电场向一定电极，荷的种类及数量，在电场向一定电极，以一定速度泳动以一定速度泳动•２、分子筛效应：区别不同大小分子种２、分子筛效应：区别不同大小分子种类的能力是凝胶所具有的一种筛分大小类的能力是凝胶所具有的一种筛分大小的能力即分子筛效应这种效应与凝胶的能力即分子筛效应这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同过滤过程中的情况不同 ３、浓缩效应３、浓缩效应Separating Proteins Based on MW•The problem associated with protein separation (too many separation parameters) has been solved by using denaturing SDS Gels–The proteins are heat denatured which makes them all the same shape (linear)–The proteins are coated with an ionic detergent (SDS) which gives all molecules approximately the same overall negative charge–Separation is based on MW aloneSDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE)三、三、DNADNA重组操作重组操作 DNADNA重组操作过程重组操作过程载体载体外源外源DNADNA片段片段外源外源DNADNA插入插入剪切剪切引入宿引入宿主细胞主细胞abbA重组重组Ab抗性筛选抗性筛选重组筛选重组筛选（一）（一）DNADNA的酶切的酶切1. 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素(1) DNA的纯度；的纯度；(2) DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3) 酶切消化反应的温度；酶切消化反应的温度；(4) DNA的分子结构；的分子结构；(5) 溶液中离子浓度及种类；溶液中离子浓度及种类；(6) 缓冲液的缓冲液的 pH值。

值2.2.酶切反应系统配制酶切反应系统配制 H2O 达到达到20ul 10X buffer 2ul DNA 少于少于5ug(5ul) 酶酶 于于2ul(20个单）个单） 其它试剂，如乙酰化蛋白，牛血清白蛋白等，其它试剂，如乙酰化蛋白，牛血清白蛋白等，有时不需要有时不需要 上述反应可按比例放大，但最大体积在上述反应可按比例放大，但最大体积在100100ulul以下为好，按现在的技术，以下为好，按现在的技术，100100ulul的酶切的酶切产物足够进行后续的操作产物足够进行后续的操作3.3.保温反应：保温反应： 温度：根据具体的限制性内切酶的反应要求，温度：根据具体的限制性内切酶的反应要求，保温可以在恒温水浴锅中，也可以在恒温培养箱保温可以在恒温水浴锅中，也可以在恒温培养箱中，也可在中，也可在PCRPCR扩增仪中进行；扩增仪中进行； 时间：时间：3 3小时。

多数情况下可以考虑酶切过夜，小时多数情况下可以考虑酶切过夜，因为按照酶的质量要求，反应过夜，仍不会对因为按照酶的质量要求，反应过夜，仍不会对DNADNA用降解作用用降解作用4.4.检测：检测： 取取1 1ulul进行电泳，如果酶切不完全，需要找原进行电泳，如果酶切不完全，需要找原因，将其酶切基本完全因，将其酶切基本完全 6.6.双酶切：双酶切： 根据重组的需要，有时需要用双酶切，这样重组效果会更好根据重组的需要，有时需要用双酶切，这样重组效果会更好 双酶切时要先分析两种酶且的条件，根据两种酶切的缓冲液要求，双酶切时要先分析两种酶且的条件，根据两种酶切的缓冲液要求，有三种情况有三种情况兼兼 容容 性性 处处 理理完全兼容完全兼容同时加同时加2 2种酶进行酶切种酶进行酶切完全不兼容完全不兼容先用一种酶切，沉淀洗盐，再用另一种酶切先用一种酶切，沉淀洗盐，再用另一种酶切相对兼容（其中相对兼容（其中一种酶活性相对一种酶活性相对较低）较低）同时加同时加2 2种酶进行酶切种酶进行酶切只是盐离子浓度只是盐离子浓度不同不同先用低离子要求的酶切，再补加酶和盐。

先用低离子要求的酶切，再补加酶和盐7.7.载体的酶切：载体的酶切： 酶切条件与外源酶切条件与外源DNADNA没有区别载体多为环没有区别载体多为环状状DNA,DNA,如果只有一个酶切位点，用单酶切另如果只有一个酶切位点，用单酶切另一种情况是用含有插入子的载体，将插入序列一种情况是用含有插入子的载体，将插入序列切除，即可获得载体切除，即可获得载体DNADNA片段，比较易于获得完片段，比较易于获得完全酶切的载体因为只一个酶切位点，酶切后全酶切的载体因为只一个酶切位点，酶切后电泳分离时环状和现状电泳分离时环状和现状DNADNA有时不能区分有时不能区分（二）电泳回收（二）电泳回收1.1.电泳分离：按照常规的琼脂糖凝胶电泳电泳分离：按照常规的琼脂糖凝胶电泳方法进行电泳分离，用方法进行电泳分离，用EBEB染色2.2.挖胶：当电泳使要分离的样品条带分离，挖胶：当电泳使要分离的样品条带分离，在紫外灯下将样品连同凝胶挖起来在紫外灯下将样品连同凝胶挖起来3.3.熔胶：一般加入熔胶：一般加入INaINa溶液溶液, ,使凝胶熔解，使凝胶熔解，DNADNA即释放玻璃奶在高盐浓度下玻璃奶在高盐浓度下Na+Na+能能破坏水中破坏水中H+H+和硅基质上和硅基质上O2-O2-之间的氢氧键之间的氢氧键, ,Na+Na+作为一作为一种阳离子桥梁种阳离子桥梁, ,能吸引能吸引DNADNA分子中的磷酸骨架上的分子中的磷酸骨架上的O2-O2-( (图图1).1).通过对通过对DNA—DNA—硅胶颗硅胶颗粒多次洗脱除去盐分后粒多次洗脱除去盐分后, ,DNADNA被从硅基质上洗脱下被从硅基质上洗脱下来来, ,转移到溶液中转移到溶液中 4.4.DNADNA分离：有两种方式，一种是用特异吸分离：有两种方式，一种是用特异吸附附DNADNA的过滤珠的过滤珠，，另一种是用石英沙吸收另一种是用石英沙吸收DNA.DNA.当当DNADNA被特异地吸附到固体介质上后，被特异地吸附到固体介质上后，用一定的溶剂除去凝胶溶液以及其它离子，用一定的溶剂除去凝胶溶液以及其它离子，使使DNADNA纯化。

纯化5.5.用用1 1XTEXTE洗脱洗脱DNADNA样品6.6.回收回收DNADNA用电泳方法鉴定用电泳方法鉴定（三）重组方法：（三）重组方法： 根据外源根据外源DNADNA和载体条件，其重组方式常和载体条件，其重组方式常常有以下几种情况：常有以下几种情况： 相同末端相同末端：直接将外源：直接将外源DNADNA和载体片段加和载体片段加在一起，进行连接在一起，进行连接 不同末端不同末端：需要将外源：需要将外源DNADNA和载体和载体DNADNA的的末端调整成一致多数情况是变成平末端，末端调整成一致多数情况是变成平末端，这可通过这可通过DNADNA酶降解，或酶降解，或DNADNA聚合酶不平的聚合酶不平的方式解决方式解决 单酶切单酶切：由于只有一种酶切，载体片段：由于只有一种酶切，载体片段很容易相互粘连，形成空载体，通常用去很容易相互粘连，形成空载体，通常用去磷酸化的方法以避免对于表达载体构建磷酸化的方法以避免对于表达载体构建时，还需识别其方向时，还需识别其方向 双酶切双酶切：直接连接，并且方向是确定的，：直接连接，并且方向是确定的，所以选择这一方案时，要考虑其方向性。

所以选择这一方案时，要考虑其方向性（四）连接（四）连接一般外源片段较载体摩尔浓度高一般外源片段较载体摩尔浓度高 ，，5 5：：1 1有的加入聚乙二醇可使反应速度加快加入聚乙二醇可使反应速度加快连接反应：连接反应：H2O H2O 补充使总体补充使总体1010ululATPATP（（含在含在buffer buffer 中）中） 1010XBuffer 1ulXBuffer 1ul外源外源DNA 1ulDNA 1ul载体载体DNA 3-4ulDNA 3-4ulT4DNAT4DNA连接酶连接酶 1 1ulul四、转化大肠杆菌四、转化大肠杆菌1.1.宿主菌培养宿主菌培养2.2.制备敏感菌制备敏感菌3.3.转化转化4.4.铺平板进行扩增和筛选铺平板进行扩增和筛选5.5.挑选：挑选： 选插入片段；选插入片段； 选择需要的克隆选择需要的克隆 文库筛选文库筛选 选择正确方向的克隆选择正确方向的克隆1.大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法法) （（1））从从新新活活化化的的E.coli DH5α菌菌平平板板上上挑挑取取一一单单菌菌落落，，接接种种于于3～～5ml LB液液体体培培养养中中，，37℃振振荡荡培培养养12h左左右右，，直直至至对对数数生生长长期期。

将将该该菌菌悬悬液液以以1:100～～1:50转转接接于于100ml LB液液体体培培养养基基中中，，37℃振振荡荡扩扩大大培培养养，，当当培培养养液液开开始始 出出 现现 混混 浊浊 后后 ，， 每每 隔隔 20～～ 30min测测 一一 次次OD600nm，，至至OD600nm≤0.5时停止培养；时停止培养；（（2））每每组组取取培培养养液液3个个2ml转转入入2ml离离心心管管中中，，在在冰冰上上冷冷却却20-30min，，于于4℃，，4000r／／min离离心心10min（（从从这这一一步步开开始始，，所所有有操操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；（（3））倒倒净净上上清清培培养养液液，，用用1ml冰冰冷冷的的0.1mo1／／L CaCl2溶溶液液轻轻轻轻悬悬浮浮细细胞胞，，冰冰浴浴；；（（4））0～～4℃，，4000r／／min离心离心10min；；（（5））弃弃去去上上清清液液，，加加入入500µl冰冰冷冷的的0.1mo1／／L CaCl2溶溶液液，，小小心心悬悬浮浮细细胞胞0～～4℃，，4000r／／min离心离心10min；；（（6））弃弃去去上上清清液液，，加加入入100µl冰冰冷冷的的0.1mo1／／L CaCl2溶溶液液，，小小心心悬悬浮浮细细胞胞，，冰冰上上放放置置片片刻刻后，即制成了感受态细胞悬液；后，即制成了感受态细胞悬液；（（7））制制备备好好的的感感受受态态细细胞胞悬悬液液可可直直接接用用于于转转化化实实验验，，也也可可加加入入占占总总体体积积15％％左左右右高高压压灭灭菌菌过过的的甘甘油油，，混混匀匀后后分分装装于于1.5ml离离心心管管中中，，置置于于-70℃条件下，可保存半年至一年。

条件下，可保存半年至一年2.细胞细胞转化转化 (1) 分别取分别取3个个100µl感受态细胞悬液感受态细胞悬液(如是如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作操作)，第一组，加入，第一组，加入10 µl重组质粒重组质粒DNA(体积不超过体积不超过10µl)+ 100µl感受态细胞感受态细胞，，此管此管为转化实验组第二组，插入为转化实验组第二组，插入DNA片段对片段对照组，即酶切后照组，即酶切后DNA片段片段25ng+100µl感受感受态细胞悬液；第三组，质粒态细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，对照组，即即1ng 未未酶切酶切pBluescript 质粒质粒DNA十十100µl感受态细胞悬液感受态细胞悬液 (2) 将将以以上上各各样样品品轻轻轻轻摇摇匀匀，，冰冰上上放放置置20-30min，，于于42℃水水浴浴中中保保温温1－－2min，，然然后后迅速冰上冷却迅速冰上冷却2min(3) 立立即即向向上上述述管管中中分分别别加加入入0.4ml LB液液体体培培养养基基（（不不需需在在冰冰上上操操作作）），，使使总总体体积积到到0.5ml，，该该溶溶液液称称为为转转化化反反应应原原液液，，摇摇匀匀后后于于37℃振振荡荡培培养养约约45-60min ，，使使受受体体菌菌恢恢复复正正常常生生长长状状态态，，并并使使转转化化体体表表达达抗抗生生素素基基因产物因产物(Ampr)。

3. 平板培养平板培养（有时需要稀释）（有时需要稀释）(1)取各样品培养液取各样品培养液0.1ml，，分别接种于分别接种于含抗菌素含抗菌素LB平板培养基上，涂匀平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫后稍微凉一下再用，不要过烫）(2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于于37℃恒温培养箱内培养过夜恒温培养箱内培养过夜(12-16小时小时)，，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落用用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒超螺旋质粒 DNA产生产生5 106-2 107个转化菌个转化菌落在实际工作中，每微克有落在实际工作中，每微克有105以上的转化以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验菌落足以满足一般的克隆实验4.重组质粒克隆的鉴定重组质粒克隆的鉴定鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有 -互补、小规模制备质粒互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、进行酶切分析、插入失活、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。

最以及杂交筛选的方法最常用的方法是小规模制备质粒常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶进行酶切分析，对于带有切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以基因的载体还可以结合结合 -互补现象来筛选互补现象来筛选 -互补现象：互补现象：因为许多载体都带有一个因为许多载体都带有一个LacLacZ Z基因的调控序基因的调控序列和头列和头146146个氨基酸的编码信息，编码个氨基酸的编码信息，编码 - -互补互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型 - -半乳糖半乳糖苷酶实现基因内互补（苷酶实现基因内互补（  -互补互补）当这种载当这种载体转入可编码体转入可编码 －半乳糖苷酶－半乳糖苷酶C C端部分序列的端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基宿主细胞中时，在异丙基- - - -D D硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷（（IPTGIPTG））的诱导下，的诱导下，宿主可同时合成这两种宿主可同时合成这两种肽段，肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质所可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质所以称这种现象为以称这种现象为 - -互补现象。

互补现象由互补产生的由互补产生的 －半乳糖苷酶－半乳糖苷酶( (LacLacZ Z) )能够作用能够作用于生色底物于生色底物5 5－溴－－溴－4 4－氯－－氯－3 3－吲哚－－吲哚－ －－D D－－半乳糖苷半乳糖苷( (X-gal)X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNADNA片段时，会造成片段时，会造成LacLacZ Z( ( ) )基因的失活，破基因的失活，破坏坏 -互补作用，互补作用，就不能产生具有活性的酶就不能产生具有活性的酶所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色组质粒的菌落为蓝色重组重组DNADNA转化细菌转化细菌过程示意图过程示意图5. 检出转化体和计算转化率检出转化体和计算转化率统计每个培养皿中的菌落数，各实验组统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养皿内菌落生长状况应如表所示培养皿内菌落生长状况应如表所示: 实验实验组组含抗菌素的平板含抗菌素的平板结果说明结果说明转化实验组转化实验组 白色白色菌落和少量菌落和少量蓝色菌落蓝色菌落说明说明有重组质粒有重组质粒导入导入细细胞中（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切进一步鉴定〕进一步鉴定〕插入插入DNA片片段对照组段对照组无菌落或极少量无菌落或极少量白色菌落白色菌落说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或有少量模板有少量模板DAN存在存在 质粒对照组质粒对照组 蓝色菌落蓝色菌落可以判断感受可以判断感受态态细胞细胞的的效率效率各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析转转化化体体总总数数＝＝菌菌落落数数×（（转转化化反反应应原原液液总总体体积积/ /涂涂板菌液体积）板菌液体积）插入频率＝蓝色菌落数插入频率＝蓝色菌落数/ /白色菌落数白色菌落数转转化化频频率率＝＝转转化化体体总总数数/ /加加入入质质粒粒DNADNA的的量量（（计计算算出每微克的转化菌落数）出每微克的转化菌落数）五、重组克隆的挑选五、重组克隆的挑选 用前述载体上的标记进行筛选难免得到一些用前述载体上的标记进行筛选难免得到一些假的克隆子。

为进一步鉴定克隆子的真假，还得假的克隆子为进一步鉴定克隆子的真假，还得采用其它方法进行筛选此外，有的重组，比如采用其它方法进行筛选此外，有的重组，比如表达载体的重组是不能利用筛选标记的，只能用表达载体的重组是不能利用筛选标记的，只能用其它方法筛选这些方法包括：其它方法筛选这些方法包括： 1. 1.电泳，电泳， 2. 2.酶切酶切 3. 3.分子杂交分子杂交 4. 4.PCRPCR扩增扩增 5. 5.测序测序1.1.电泳方法电泳方法 挑取重组克隆，用快速抽提质粒挑取重组克隆，用快速抽提质粒DNA,DNA,然后进行然后进行电泳分析，重组质粒较空载体大电泳分析，重组质粒较空载体大上样孔空载体重组体2 2、限制性内切酶分析法、限制性内切酶分析法 这是一种最简单也是最常用的方法，这是一种最简单也是最常用的方法，从克隆子提取从克隆子提取DNADNA，，经凝胶电泳检测，若出经凝胶电泳检测，若出现外现外DNADNA带，可初步认定是克隆子；在此基带，可初步认定是克隆子；在此基础上，回收外源础上，回收外源DNADNA，，根据实验设计选用一根据实验设计选用一些限制性内切酶切割，进一步用凝胶电泳些限制性内切酶切割，进一步用凝胶电泳检测，如果检测结果同原来用于转化的外检测，如果检测结果同原来用于转化的外源源DNADNA被这些酶切割的结果一致，则可认为被这些酶切割的结果一致，则可认为是真的克隆子。

是真的克隆子上样孔未酶切重组体载体片段插入片段限制性内切酶分析图谱限制性内切酶分析图谱3 3、分子杂交法、分子杂交法 根据实验设计，先制备含目的基因的根据实验设计，先制备含目的基因的DNADNA片段的探针，随后采用斑点杂交或片段的探针，随后采用斑点杂交或DNADNA印迹印迹( (southern blotting)southern blotting)等方法进行鉴定等方法进行鉴定1)(1)斑点杂交法斑点杂交法 (2)(2)southernsouthern杂交法杂交法4 4、、PCRPCR法法 根据含目的基因两端或两侧已知核昔酸根据含目的基因两端或两侧已知核昔酸序列，设计合成一对引物，以待鉴定的克序列，设计合成一对引物，以待鉴定的克隆子的隆子的DNADNA为模板进行扩增，若获得特异性为模板进行扩增，若获得特异性扩增扩增DNADNA片段，表明待鉴定的克隆子含有目片段，表明待鉴定的克隆子含有目的基因，是真的克隆子此方法的优点是的基因，是真的克隆子此方法的优点是灵敏、快速，并且可证实是完整的目的基灵敏、快速，并且可证实是完整的目的基因而采用因而采用DNADNA分子杂交的方法，只要在被分子杂交的方法，只要在被杂交的杂交的DNADNA中存在目的基因的一部分中存在目的基因的一部分DNADNA序序列，就会出现杂交信号。

列，就会出现杂交信号PCRPCR检测重组克隆引物设计检测重组克隆引物设计重组克隆重组克隆 上样孔含有插入片段 空克隆PCRPCR检测重组克隆电泳图谱检测重组克隆电泳图谱5 5、、DNADNA测序法测序法 以上方法可断定克隆子含有目的基因，但并以上方法可断定克隆子含有目的基因，但并不能了解目的基因的核苷酸序列在一系列操作过不能了解目的基因的核苷酸序列在一系列操作过程中是否发生了变化为此还必须进行目的基因程中是否发生了变化为此还必须进行目的基因的核苷酸测序如果待测序的目的基因比较大，的核苷酸测序如果待测序的目的基因比较大，测序有困难，也可用测序有困难，也可用RFLP(RFLP(限制性片段长度多态限制性片段长度多态性性) )技术用限制性内切酶对待克隆的目的基因技术用限制性内切酶对待克隆的目的基因和已克隆的目的基因进行切割，若凝胶电泳结果和已克隆的目的基因进行切割，若凝胶电泳结果不一致，可断定克隆子中克隆的不是目的基因，不一致，可断定克隆子中克隆的不是目的基因，或者克隆的目的基因的核苷酸序列已发生了变化或者克隆的目的基因的核苷酸序列已发生了变化。

经多种限制性内切酶切割分析，若两者结果都一经多种限制性内切酶切割分析，若两者结果都一样，可认为克隆子中克隆的是原定的目的基因，样，可认为克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核苷酸序列没有变化其核苷酸序列没有变化6.6.插入片段方向确定插入片段方向确定 A B引物1 Yes No引物2 No Yes1.1.PCR PCR 法鉴定重组克法鉴定重组克隆方向的引物设计隆方向的引物设计 A0.5+2.35=2.85(kb)1.2+1.56=276(kb) B2.35+1.2=3.55(kb)1.56+0.5=2.06(kb)2.酶切法鉴定重组克隆方向酶切法鉴定重组克隆方向Marker A B根据左图：根据左图：A A为左向；为左向；B B为右向。

为右向3.测序法鉴定测序法鉴定 仍然以载体上的序列为依据设计仍然以载体上的序列为依据设计测序引物，测序结果直接确定克隆测序引物，测序结果直接确定克隆方向。