L-天冬酰胺酶的生产工艺ppt课件.ppt

生工本2009级4班 刘培培20092513418 L 天冬酰胺酶的生产工艺 LOGO 2020 6 19 1 一 天冬酰胺酶的化学组成和性质 天冬酰胺酶是酰胺基水解酶 是大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物 用于治疗白血病 1922年Clementi发现豚鼠血清中存在天冬酰胺酶 1953年Kidd发现豚鼠血清中有抑癌作用的物质 其活性成分是蛋白质 1961年Broome确定了其有效成分是天冬酰胺酶 后来 Mashburn等报告指出从大肠杆菌中分离出天冬酰胺酶 具有同样抗癌活性 天冬酰胺酶呈白色粉末状 微有湿性 溶于水 不溶于丙酮三氯甲烷乙醚和甲醇 水溶液20 储存7d 5 储存14d均不减少酶的活力 干品50 15min酶活力降低30 60 1h内失活 最适PH8 5 最适温度37 2020 6 19 2 二 国内天冬酰胺酶的发展历程 目前 国内临床上应用的L2ASP主要来源于大肠杆菌 我国天津生化厂于1974年开始生产E1coli天冬酰胺酶 但由于菌种产酶能力低 提取精制工艺落后 难以与国外产品竞争 再加之其他原因最后停产 为了填补国内空白 1995年 中国药科大学吴梧桐教授等率先进行了E1coli天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表达研究 并首次在国内成功构建了高效表达L2ASP的基因工程菌pKA CPU210009 工程菌发酵单位比野生株高出100倍 随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺 确定了重组L2ASP的纯化路线 并对重组产品进行了鉴定 结果表明 基因工程菌生产的产品质量与天然品从基因序列 蛋白质一级结构到蛋白质的物理化学性质等方面均一致 两者具有同质性 这些研究成果为我国工业化生产优质 低价的注射用E1coliL2ASP开辟了新的道路 2020 6 19 3 三 抗肿瘤机制 L2ASP抗肿瘤的作用机制在于它能够降低人体内L2天冬酰胺和L2谷氨酰胺的浓度 这两种氨基胞缺乏天冬酰胺合成酶 不能合成L2天冬酰胺 需酸是合成嘌呤环和嘧啶环的重要组成部分 肿瘤细要摄取外源L2天冬酰胺才能存活 当外源L2天冬酰胺被分解掉时 癌细胞合成核苷酸和蛋白质的能力就会显著降低 因此L2ASP能有效抑制肿瘤细胞的增殖 有研究表明 L2ASP能够选择性抑制体内Ra2pamycin2靶标信号传导通路 从而抑制肿瘤的增值 另有文献报道 L2ASP在体内发挥作用时可能是通过一种功能性的p53蛋白因子来介导肿瘤细胞的凋亡 2020 6 19 4 四 工艺流程 大肠杆菌产生的L2ASP包括L2ASP 和L2ASP 其中L2ASP 存在于细胞质中 与底物L2天冬酰胺的亲和力很小 Km 1 10 3mol L 没有抗肿瘤活性 而L2ASP 则分泌在细胞周质中 与L2天冬酰胺有很高的亲和力 Km 1 10 5mol L 有抗癌活性 3 现今 产生L2ASP 的菌种主要包括Escherichiacoli Erwiniacarotovara Serraliamarcescem PseudomonasSp1 Wolinellasuccinogenes等 主要采用的提纯方法包括硫酸铵分级沉淀 乙醇分级沉淀 离子交换层析法 超滤 水系二相胶束系统 分批式吸附和直行式解吸附法 渗透休克法以及亲和层析法等 8 16 采用不同方法最终得到目标产物的酶活力范围为220 520157U mg 总回收率为31 86 2020 6 19 5 天冬酰胺酶工艺流程图 大肠杆菌 肉汤菌种 种子菌种 发酵液 菌体 提取液 上清液 沉淀 洗脱液 洗脱液 冻干 L 天冬酰胺酶 菌种培养 肉汤培养基37 48h 玉米浆培养基37 4 8h 种子培养 发酵 玉米浆培养基37 6 8h 离心 提取 蔗糖抽提液PH7 530 分级沉淀 NH4 2SO455 饱和度PH7 0 分级沉淀 NH4 2SO490 饱和度 离子沉淀 DEAE 纤维素 DE52 离子交换 CM 纤维素 CM52 2020 6 19 6 工艺过程及要点 1菌种培养采用大肠杆菌EscherichiacoliA S 1 357 培养基加牛肉汁100mL 蛋白胨1g 氯化钠0 5g 琼脂2 2 5g37 在试管中培养24h 茄形瓶培养8h 锥形瓶培养16h 2种子培养培养基用玉米浆30kg 加水至300kg 接种量1 1 5 37 通气搅拌培养4 8h 2020 6 19 7 一 总述 3发酵罐培养取玉米浆100Kg 接种量8 37 通气搅拌培养6 8h 离心分离发酵液 得菌体加2倍量丙酮搅拌 压滤 滤饼过筛 自然风干成菌体干粉 4蔗糖溶液抽提将菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖溶液 蔗糖40 溶菌酶200mg L EDTA10mmol L PH7 5 30 振荡2h 8000r min离心 收取上层酶液 2020 6 19 8 5硫酸铵分级沉淀取上述酶液 加入 NH4 2SO4至55 饱和度 调PH至7 0 室温搅拌1h 离心除去沉淀 取上清液加入 NH4 2SO4到90 饱和度 离心收集沉淀 6纯化将沉淀用50mmol L PH7 0磷酸缓冲液溶解并透析 透析后的酶液 通过预先用10mmol L PH7 6磷酸缓冲液平衡的DEAE 纤维素层析柱 1cm 30cm 用30mmol L磷酸缓冲液洗脱 流速为40mL h 收集天冬酰胺酶活性组分 再调整PH4 8 通过预先用50mmol L PH4 9的磷酸缓冲液平衡的CM 纤维素层析柱 1cm 8cm 用50mmol L PH5 2的磷酸缓冲液洗脱 收集酶活性组分 冷冻干燥 即得L 天冬酰胺酶冻干粉 总收率为31 比活为220U mg蛋白 2020 6 19 9 二 工艺流程图 1 丝状菌三级发酵工艺流程冷冻管 25 C 孢子培养 7天 斜面母瓶 25 C 孢子培养 7天 大米孢子 26 C 种子培养56h 一级种子培养液 27 C 种子培养 24h 二级种子培养液 27 26 C 发酵 7天 发酵液 2 球状菌二级发酵工艺流程冷冻管 25 C 孢子培养 6 8天 亲米 25 C 孢子培养 8 10天 生产米 28 C 孢子培养 56 60h 种子培养液 26 25 24 C 发酵 7天 发酵液 2020 6 19 10 三 青霉素发酵过程 青霉素发酵时 青霉素生产菌在合适的培养基 PH 温度和通气搅拌等发酵条件下进行生长并合成青霉素 发酵开始前 有关设备和培养基 主要是碳源 氮源 前体和无机盐等 必须先经过灭菌 后接入种子 在整个过程中 需要不断通气和搅拌 维持一定的罐温和罐压 在发酵过程中往往要加入泡沫剂 假如酸碱控制发酵液的PH 还需要间歇或连续的加入葡萄糖及铵盐等化合物以补充碳源及氮源 或补进其他料液和前体等以促进青霉素的生产 2020 6 19 11 青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长 青霉素合成和菌体自溶三个阶段 菌体生长阶段 发酵培养基接种后生产菌在合适的环境中经过短时间的适应 即开始发育 生长和繁殖 直至达到菌体的临界浓度 青霉素合成阶段 这个阶段主要合成青霉素 青霉素的生产速率达到最大 并一直维持到青霉素合成能力衰退 在这个阶段 菌体重量有所增加 但产生菌的呼吸强度一般无显著变化 菌体自溶阶段 这个阶段菌体衰老 细胞开始自溶 合成青霉素能力衰退 青霉素生产速率下降 氨基氮增加 PH上升 2020 6 19 12 后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用 2020 6 19 13 主要经营 网络软件设计 图文设计制作 发布广告等公司秉着以优质的服务对待每一位客户 做到让客户满意 2020 6 19 14 致力于数据挖掘 合同简历 论文写作 PPT设计 计划书 策划案 学习课件 各类模板等方方面面 打造全网一站式需求 2020 6 19 15 感谢您的观看和下载 Theusercandemonstrateonaprojectororcomputer orprintthepresentationandmakeitintoafilmtobeusedinawiderfield 2020 6 19 16 。