2022年分子病理学（教学课件）.ppt

分子病理学常用研究方法分子病理学常用研究方法 (一一)基因变异的诊断基因变异的诊断 Southern blot,PCR,RT-PCR,Real-Time RT-PCR,FISH分子遗传学异常检测方法分子遗传学异常检测方法检测基因的丧失和扩增检测基因的丧失和扩增 比较基因组杂交比较基因组杂交 Comparative Genomic Hybridization,CGH 分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合 优点：优点：1.新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可 进行进行CGH研究研究 2.被测样品只需数被测样品只需数mg甚至不到甚至不到1 mg的的DNACGH的应用：的应用：为搜寻肿瘤的癌基因或抑癌基因确定范围为搜寻肿瘤的癌基因或抑癌基因确定范围肿瘤细胞染色体某一位置上肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数增加，序列拷贝数增加，往往提示该位置可能包含或未知的癌基因有扩增往往提示该位置可能包含或未知的癌基因有扩增肿瘤细胞染色体某一位置上肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数减少或序列拷贝数减少或缺失，提示该位置可能包含或未知的抑癌基因丧缺失，提示该位置可能包含或未知的抑癌基因丧失失 CGH发现发现MYCN，MET与胃癌相关与胃癌相关2.区分良恶性病变，临床上估计预后区分良恶性病变，临床上估计预后3.4.16例前列腺癌例前列腺癌CGH显示染色体异常占显示染色体异常占81%5.5例良性前列腺增生全部阴性例良性前列腺增生全部阴性 67肝细胞癌肝细胞癌CGH显示显示:1q,8q,20q,17q 4q,8p,13q,16q 12例癌周肝硬化组织：阴性例癌周肝硬化组织：阴性 53例淋巴结阴性乳腺癌：例淋巴结阴性乳腺癌：8q,11q13,17q,20q异常，预后差异常，预后差 蛋白组学及生物芯片蛋白组学及生物芯片生物芯片生物芯片biochip)是指采用光导原位合成或微量点样等方法将大量是指采用光导原位合成或微量点样等方法将大量核酸片段寡核苷酸、核酸片段寡核苷酸、cDNA、基因组、基因组DNA、RNA或多肽分子甚至细胞等生物样品有序地固或多肽分子甚至细胞等生物样品有序地固定于支持物玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼定于支持物玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体的外表，组成密集的二维分子排列，龙膜等载体的外表，组成密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机像机CCD对杂交信号的强度进行快速、并行、对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量改变。

改变生物芯片：生物芯片：基因芯片基因芯片 蛋白质芯片蛋白质芯片 细胞芯片细胞芯片 组织芯片组织芯片基因芯片基因芯片(Affymetrix 专利专利 寡核苷酸芯片，寡核苷酸芯片，cDNA芯片，基因组芯片芯片，基因组芯片 DNA microarray:阵密度很高的玻片基质或阵密度很高的玻片基质或胶膜基质胶膜基质 的的DNA微阵列微阵列 DNA macroarray:阵密度较低的尼龙膜阵密度较低的尼龙膜DNA微阵列微阵列 杂交组织化学杂交组织化学杂交组织化学杂交组织化学-概述概述概述概述一、概述和原理一、概述和原理一、概述和原理一、概述和原理杂交组织杂交组织杂交组织杂交组织/细胞化学细胞化学细胞化学细胞化学(Hybridohistochemistry)(Hybridohistochemistry)原位分子杂交原位分子杂交原位分子杂交原位分子杂交(Insituhybridization,ISH)(Insituhybridization,ISH)运用核酸分子间硷基互补的性质结合免疫组织化运用核酸分子间硷基互补的性质结合免疫组织化运用核酸分子间硷基互补的性质结合免疫组织化运用核酸分子间硷基互补的性质结合免疫组织化学技术在组织切片学技术在组织切片学技术在组织切片学技术在组织切片(或细胞片或细胞片或细胞片或细胞片)上显示特异核酸上显示特异核酸上显示特异核酸上显示特异核酸(DNA(DNA或或或或RNA)RNA)序列的一种技术。

序列的一种技术序列的一种技术序列的一种技术杂交组织化学原理杂交组织化学原理标记探针杂交变性 标记探针 互补核酸顺序 DNA/cDNA DNA DNA/cDNA RNA RNA RNA核酸分子杂交种类：固相杂交核酸分子杂交种类：固相杂交核酸分子杂交种类：固相杂交核酸分子杂交种类：固相杂交(硝酸纤维素膜或尼龙膜硝酸纤维素膜或尼龙膜硝酸纤维素膜或尼龙膜硝酸纤维素膜或尼龙膜)SouthernSouthern印迹转移印迹转移印迹转移印迹转移(DNA)(DNA)NorthernNorthern印迹转移印迹转移印迹转移印迹转移(RNA)(RNA)液相杂交液相杂交液相杂交液相杂交原位杂交原位杂交原位杂交原位杂交原位杂交四要素：原位杂交四要素：原位杂交四要素：原位杂交四要素：适当的探针适当的探针适当的探针适当的探针良好的组织材料良好的组织材料良好的组织材料良好的组织材料可靠的试剂和方法可靠的试剂和方法可靠的试剂和方法可靠的试剂和方法相当的形态学根底相当的形态学根底相当的形态学根底相当的形态学根底二、探针的制备二、探针的制备二、探针的制备二、探针的制备1.1.探针的种类和制备探针的种类和制备探针的种类和制备探针的种类和制备DNADNA探针：应用多，操作容易探针：应用多，操作容易探针：应用多，操作容易探针：应用多，操作容易比较敏感，背景高比较敏感，背景高比较敏感，背景高比较敏感，背景高(自身网络自身网络自身网络自身网络)双链双链双链双链DNADNA探针用时要变性探针用时要变性探针用时要变性探针用时要变性 整整整整合合合合 转转转转化化化化 扩增扩增扩增扩增 DNADNA片片片片段段段段 质质质质粒粒粒粒(或或或或其其其其他他他他载载载载体体体体)细细细细菌菌菌菌提取提取提取提取酶切酶切酶切酶切质粒质粒质粒质粒探针探针探针探针(PCR(PCR扩增扩增扩增扩增)线性质粒 提取质粒扩增 探针重组质粒 质粒酶切插入 转染 探针RNARNA探针探针探针探针：结合稳定，穿透性好：结合稳定，穿透性好：结合稳定，穿透性好：结合稳定，穿透性好无需变性，不存在退火问题无需变性，不存在退火问题无需变性，不存在退火问题无需变性，不存在退火问题未杂交探针可用未杂交探针可用未杂交探针可用未杂交探针可用RNaseRNase去除，背景好去除，背景好去除，背景好去除，背景好多采用体外转录法合成同时加以标记多采用体外转录法合成同时加以标记多采用体外转录法合成同时加以标记多采用体外转录法合成同时加以标记 寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针：合成快速，不用变性，对：合成快速，不用变性，对：合成快速，不用变性，对：合成快速，不用变性，对RNaseRNase不敏感不敏感不敏感不敏感30-150bp30-150bp，组织通透性好，组织通透性好，组织通透性好，组织通透性好未端标记，敏感度不够未端标记，敏感度不够未端标记，敏感度不够未端标记，敏感度不够多采用多采用多采用多采用DNADNA合成仪固相合成合成仪固相合成合成仪固相合成合成仪固相合成探针的选择探针的选择探针的选择探针的选择:特异性特异性特异性特异性多项选择择基因组的多项选择择基因组的多项选择择基因组的多项选择择基因组的55或或或或33端端端端20-5020-50对碱基互补就已稳定对碱基互补就已稳定对碱基互补就已稳定对碱基互补就已稳定大大大大小小小小200-300200-300对碱基互补可获强的复合体对碱基互补可获强的复合体对碱基互补可获强的复合体对碱基互补可获强的复合体 原位杂交多项选择择原位杂交多项选择择原位杂交多项选择择原位杂交多项选择择100-400bp(1000bp)100-400bp(DNA-RNADNA-DNARNA-RNADNA-RNADNA-DNA2.2.探针的标记探针的标记探针的标记探针的标记 标记物标记物标记物标记物：同位素：同位素：同位素：同位素,非同位素非同位素非同位素非同位素,修饰物修饰物修饰物修饰物同位素：同位素：同位素：同位素：敏感，定位较差，实验室要求高敏感，定位较差，实验室要求高敏感，定位较差，实验室要求高敏感，定位较差，实验室要求高探针使用周期短探针使用周期短探针使用周期短探针使用周期短3232P P放射过强放射过强放射过强放射过强,定位差定位差定位差定位差,半衰期短半衰期短半衰期短半衰期短(14.3(14.3天天天天)3535S S最常用最常用最常用最常用,定位好定位好定位好定位好,曝光时间短曝光时间短曝光时间短曝光时间短(数天数天数天数天),),半衰期较长半衰期较长半衰期较长半衰期较长(84(84天天天天)125125I I与与与与3535S S相似，但半衰期较短相似，但半衰期较短相似，但半衰期较短相似，但半衰期较短(60(60天天天天)3 3H H常用常用常用常用,放射能小放射能小放射能小放射能小,定位准确定位准确定位准确定位准确,曝光时间长曝光时间长曝光时间长曝光时间长(数周数周数周数周),),半衰期长半衰期长半衰期长半衰期长非同位素：非同位素：非同位素：非同位素：定位较好，实验室要求低，可长期使用定位较好，实验室要求低，可长期使用定位较好，实验室要求低，可长期使用定位较好，实验室要求低，可长期使用生物素生物素生物素生物素：最早用，特点与免疫组化相似：最早用，特点与免疫组化相似：最早用，特点与免疫组化相似：最早用，特点与免疫组化相似地高辛地高辛地高辛地高辛：最常用，敏感性高，特异性好：最常用，敏感性高，特异性好：最常用，敏感性高，特异性好：最常用，敏感性高，特异性好荧光素荧光素荧光素荧光素：方法简便，敏感性低，多用于染色体检查：方法简便，敏感性低，多用于染色体检查：方法简便，敏感性低，多用于染色体检查：方法简便，敏感性低，多用于染色体检查修饰物修饰物修饰物修饰物(现少用现少用现少用现少用)：磺基化：磺基化：磺基化：磺基化(Sulphon(Sulphon基团基团基团基团)乙酰氨基芴乙酰氨基芴乙酰氨基芴乙酰氨基芴光敏生物素光敏生物素光敏生物素光敏生物素汞汞汞汞 标记方法标记方法标记方法标记方法 引入法：引入法：引入法：引入法：运用标记好的核苷酸合成探针运用标记好的核苷酸合成探针运用标记好的核苷酸合成探针运用标记好的核苷酸合成探针缺口翻译法缺口翻译法缺口翻译法缺口翻译法随机引物法随机引物法随机引物法随机引物法末端标记法末端标记法末端标记法末端标记法PCRPCR扩增标记法扩增标记法扩增标记法扩增标记法RNARNA体外合成法体外合成法体外合成法体外合成法化学修饰法：化学修饰法：化学修饰法：化学修饰法：化学修饰已合成的探针化学修饰已合成的探针化学修饰已合成的探针化学修饰已合成的探针缺口翻译缺口翻译缺口翻译缺口翻译/平移法：平移法：平移法：平移法：双链双链双链双链DNADNA标记，线环状均可标记，线环状均可标记，线环状均可标记，线环状均可分子较大分子较大分子较大分子较大(1KB)(1KB)者效果好者效果好者效果好者效果好DNADNA用量较多用量较多用量较多用量较多(200ng)(200ng)标记率低标记率低标记率低标记率低原理：原理：原理：原理：DNADNA酶酶酶酶(DNaseI)(DNaseI)在双链在双链在双链在双链DNADNA分子中导入缺口分子中导入缺口分子中导入缺口分子中导入缺口DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶(DNApolI(DNApolI，具有，具有，具有，具有5353外切酶和外切酶和外切酶和外切酶和5353聚合酶活性聚合酶活性聚合酶活性聚合酶活性)，使各种核苷酸，使各种核苷酸，使各种核苷酸，使各种核苷酸，包括包括包括包括标记核苷酸自缺口处合成与对应链互补的标记核苷酸自缺口处合成与对应链互补的标记核苷酸自缺口处合成与对应链互补的标记核苷。