限制性内切酶1Jun.ppt

第二章 基因工程中常用的工具酶基因工程的 基本流程TOOLS FOR GENE CLONINGSCISSORS: RESTRICTION ENZYMESGLUE: DNA LIGASEVEHICLE: PLASMID OR VIRAL VECTORS第二章 基因工程中常用的工具酶第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第二节 DNA连接酶和DNA分子的体外连接第三节 其他工具酶一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途 第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割一、限制性内切酶的发现和 细菌的限制—修饰作用1、细菌的限制和修饰系统的发现• 1950年代初期，两组科学家几乎同时发现了限制修饰现 象，当时称为宿主专一性:1952年，Luria, Humann等：T偶数噬菌体,1953年，Bertani, Weigle等：λ和P2噬菌体• 大量的研究结果证实λ噬菌体所表现的宿主限制和修饰现 象更具普遍性和代表性E. coli-λ噬菌体的 限制修饰模式 •  噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。

• 仍有少量λ(K)可在 E.coli B中生存，是因 E.coli B对λ(K)进行了修饰1959年，瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论：核酸内切酶降解细菌外源DNA,修饰酶保护自身DNA2. 细菌的限制—修饰理论的提出侵入细菌体内的外源DNA（非甲基化），能被限制性内切酶识别和 降解，细菌通过这种方式进行自我保护n细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，① Dam甲基化酶 -- 在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基② Dcm甲基化酶 -- 在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入甲基2. 细菌的限制—修饰理论n细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从而防止限制性内切酶的识别 和水解•Werner Arber于1962-1968年发现限制与修饰体系， 1968年分离得到I型限制酶 EcoB. •1970 年，H. Smith 首次从流感嗜血杆菌 （H. influenzae）中发现并分离到II型限制酶 HindⅡ.•1971年，D. Nathans用HindII绘制了猿猴病毒SV40 的限制酶谱 Arber, Smith和Nathans 获得了1978 年Nobel生理学和医学奖。

3. 限制性核酸 内切酶的发现•到1986 年下半年，发现 615 种限制酶和 98 种甲基化酶•到 2006 年2 月，共发现 4583 种限制酶 和甲基化酶，其中限制酶有 3773 种，Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型限制酶各有 68 、3692 、10 种3. 限制性核酸内切酶的发现一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途 第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割• 限制性内切酶系统中有两个部分组成：1.核酸酶2.甲基化酶•来源：细菌染色体、噬菌体/病毒•限制性内切酶不仅受病毒感染的影响，还可随DNA的连接、转导或转染而传给其他个体二、限制性核酸内切酶的定义•限制性内切酶 是一组可以特异性地识别DNA上的某一特定 序列，并将之水解的核酸酶限制性核酸内切 酶，是一类能够识 别双链DNA分子中的 某种特定核苷酸序 列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内 切酶n限制酶裂解DNA 双链的磷酸二酯 键n酶切得到5`-P和 3`-OH一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途 第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割三、限制性核酸内切酶的命名①第1个字母大写，表示来源物种属名的第一个字母。

②第2、3个字母小写，表示来源物种种名的前二个字母③如果细菌有不同的血清型，则有第四个字母，小写，且与前3个字母紧紧排在一起Hind Ⅲ：Haemophilus influensae d④当控制宿主的限制、修饰系统的遗传因子位于病毒和质粒上时，需要在名称中标出遗传成分Eco RI：Escherichia coli R⑤若从一种细菌中分离出几种不同的酶，则根据发现顺序用罗马数字表示Sac I (II)：Streptomyces achromagenes I(Ⅱ)一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途 第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割性质酶Ⅰ酶Ⅱ酶Ⅲ结构与功能三亚基多功能酶单一功能的酶 同型二聚体二亚基双功能的酶限制与修饰酶蛋白同时具有甲 基化作用酶蛋白不具有甲基 化作用酶蛋白同时具有甲 基化作用 限制作用的 辅助因子ATP,Mg2+,SAM （S-腺苷甲硫氨酸 ）Mg2+ATP,Mg2+,SAM寄主特异性 位点序列特异性, 非对称序列特异性, 旋转对称序列特异性, 非对称序列 切割位点在距寄主特异性位 点至少1kb的地方位于寄主特异性位 点或其附近在距寄主特异性位 点3´端24~26bp处 切割方式随机切割特异切割特异切割甲基化作用 位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点在DNA克隆中 的用途无十分有用有用四、限制性核酸内切酶的分类及主要特征一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途 第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割五、II型限制性核酸内切酶的基本特性• 是用途最广、最简单的一种限制性内切酶。

• II型限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如PvuII (157个氨基酸)，也可以比1250个氨基酸的CjeI更大在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列•根据酶的作用特点，II型限制性内切酶分为3类： A.最普遍的是HhaI、HindIII和NotI这样在识别序列中进行切 割的酶有以下4种情况：a)大部分这类酶都以同源二聚体的形式结合到DNA上，因而 识别的是对称序列； b)但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列 c)一些酶识别连续的序列(如EcoRI识别GAATTC) d)而另一些识别不连续的序列(如BglI识别GCCNNNNNGGC)1、根据酶作用特点进行的分类五、II型限制性核酸内切酶的基本特性B. IIS型酶• 另一种比较常见的酶是所谓的IIS型酶，比如 FokI和AlwI，它们在识别位点之外切开DNA 这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸 左右；它们识别连续的非对称序列，有一个 结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功 能域一般认为这些酶主要以单体的形式结 合到DNA上，但与临近的酶结合成二聚体， 协同切开DNA链。

因此一些IIS型的酶在切割 有多个识别位点的DNA分子时，活性可能更 高C.第三种II型限制性内切酶 • 第三种II型限制性内切酶(有时也被称为IV型限制性 内切酶)是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的 酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上 同时具有限制和修饰酶活性有些酶识别连续序列， 并在识别位点的一端切开DNA链；而另一些酶识别 不连续的序列(如BcgI：CGANNNNNNTGC)，并在 识别位点的两端切开DNA链，产生一小段含识别序 列的片段 • 这些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致 的他们在N端由一个负责切开DNA的功能域，这个 域又与DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特 异序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在 当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶 的功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化a.识别位点与酶切位点高度一 致，具有高度特异性 b.极为稳定 c.辅酶: Mg 2+2、II型限制性内切酶的特点五、II型限制性核酸内切酶的基本特性（1）限制酶识别序列的长度 限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列 被称为识别序列。

识别序列的长度一般为 4～8 个碱基，最 常见的为 6 个碱基 切割频率理论上为 1/4n（n为识别序列长度），实际上 与序列有关3、识别序列MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC；SfiI GGCC N N N N N GGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起五、II型限制性核酸内切酶的基本特性（3）限制酶识别序列的结构 ►限制酶识别序列大多具有回文对称结构 EcoRI 5’-G A A T T C-3’3’-C T T A A G-5’ ►有些限制酶的识别序列不对称 AccBSⅠ C C G ↓ C T C G G C ↑ G A G （2）富含GC Ⅱ型酶识别回文序列►有些限制酶可识别多种序列 ►有些限制酶识别的序列呈间断对称， 对称序列之间含有若干个任意碱基 AlwNⅠ C A G N N N C T G G T C N N N G A C AccⅠ G T M K A CC A K M T G M = A、C K = G、T（4）限制酶切割的位置 限制酶对 DNA 的切割位置大 多数在识别序列内部，但也有在 外部的。

（5）限制酶切后产生两个末端，末 端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ4．末端种类(切割方式)（1）5’-黏性末端和3’-黏性末端（cohesive end） 识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切 割后，产生的末端为黏性末端，这样形成的两个 末端是相同的，也是互补的 （2）平末端（Blunt end） 在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则 产生平末端如 Hae Ⅲ（GG↓CC）和 EcoR V（GAT↓ATC）五、II型限制性核酸内切酶的基本特性粘性末端的意义连接方便n不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补 就可以连接这比连接两个平齐末端容 易的多n同一个DNA分子内连接：通过两个相同的 粘性末端可以连接成环形分子5’末端标记n凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P 标记 3’末端标记n凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多 聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工 粘性末端 补平成平齐末端n粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端粘性末端的意义部 分 常 用 的 限 制 性 内 切 酶（3）非互补黏性末端(不对称末端)当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA 产物的末端是不同的。

BbvCⅠ C C T C A G C G G A G T C GC C T C A G CG G A G T C G能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI 5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG; CTCGGG; CCCGAG; CTCGAG (1).识别不同，切割不同 eg: BamHI EcoRI-G GATC  C- - A  GATCT- -C  CTAG G- - T CTAG  A-(2).识别不同，切割产生末端相同(同尾酶)eg: BamHI 。