医学专题—乙肝疫苗的生产工艺.ppt

乙肝疫苗的制备(zhìbèi)(zhìbèi)第一页，共十二页•乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物疫乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物疫苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗体，这种抗体存在于人的体液之中，乙肝体，这种抗体存在于人的体液之中，乙肝病毒一旦出现，抗体会立即作用病毒一旦出现，抗体会立即作用(zuòyòng)，将，将其清除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从其清除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从而使人体具有了预防乙肝的免疫力，从而而使人体具有了预防乙肝的免疫力，从而达到预防乙肝感染的目的接种乙肝疫苗达到预防乙肝感染的目的接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法是预防乙肝病毒感染的最有效方法 第二页，共十二页•基因工程乙肝疫苗是乙肝表面抗原（HbsAg）亚单位疫苗，它系采用现代生物技术将乙肝病毒表达表面抗原的基因进行质粒构建，克隆进入啤酒酵母菌或CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中，通过培养这种重组酵母菌或CHO细胞来表达乙肝表面抗原亚单位发酵后经过细胞破碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附(xīfù)、洗脱等工序，再经过疏水层析，可使产品抗原蛋白纯度达99%以上。

第三页，共十二页乙肝疫苗的制造(zhìzào)(zhìzào)工艺•1.目的基因的获取(huòqǔ)•2.工程菌的构建•3.目的基因的表达•4. 蛋白质的分离纯化第四页，共十二页  目的基因的获取目的基因的获取    编码乙型肝炎表面抗原的基因的获取编码乙型肝炎表面抗原的基因的获取    一般的目的基因的获取方法有：一般的目的基因的获取方法有：　反转录法　　化学合成法　　　反转录法　　化学合成法　　    反转录反转录—聚合酶链反应法聚合酶链反应法  工程菌的构建工程菌的构建(ɡòu jiàn)     CHO(中国仓鼠卵巢）细胞的特点中国仓鼠卵巢）细胞的特点     ①①具有准确的转录后修饰功能具有准确的转录后修饰功能 ,表达的糖基化药表达的糖基化药 物蛋白在分子结构、理化特物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最性和生物学功能方面最 接近于天然蛋白分子接近于天然蛋白分子     ②②具有产物胞外分泌功具有产物胞外分泌功 能能 ,便于下游产物分离纯化便于下游产物分离纯化;     ③③具有重组基因的高效具有重组基因的高效 扩增和表达能力扩增和表达能力;      ④④具有贴壁生长特性具有贴壁生长特性 ,且有较高的且有较高的 耐受剪切力和渗透压能力耐受剪切力和渗透压能力 ,可以进行悬浮培养可以进行悬浮培养 ,表达表达 水平较高水平较高;     ⑤⑤CHO 细胞属于成纤维细胞细胞属于成纤维细胞 (fibrob2last) ,很少分泌自身的内源蛋白很少分泌自身的内源蛋白 ,利于利于外源蛋白的后分离外源蛋白的后分离  目的基因的表达目的基因的表达  蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化    细胞破碎细胞破碎→固液分离固液分离→浓缩与初步纯化浓缩与初步纯化→高度纯化高度纯化→成品加工成品加工第五页，共十二页。

生产工艺控制生产工艺控制(kòngzhì)(kòngzhì)•基因工程乙肝疫苗的生产工艺包括发酵、提取、纯化、吸基因工程乙肝疫苗的生产工艺包括发酵、提取、纯化、吸附、配制、分装等工序附、配制、分装等工序•生产工艺中采用世界一流的发酵罐，通过全自动控生产工艺中采用世界一流的发酵罐，通过全自动控制，提供酵母菌最优生长条件，发酵后经过细胞破制，提供酵母菌最优生长条件，发酵后经过细胞破碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附、洗脱等工序，碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附、洗脱等工序，再经过疏水层析，可使产品抗原蛋白纯度达再经过疏水层析，可使产品抗原蛋白纯度达99%以以上上•所有工艺设备可自动清洗、自动灭菌，有效地减少所有工艺设备可自动清洗、自动灭菌，有效地减少了种种了种种(zhǒngzhǒng)人为因素的干扰，确保生产稳定和质人为因素的干扰，确保生产稳定和质量一致性量一致性第六页，共十二页蛋白质的分离(fēnlí)(fēnlí)纯化 第七页，共十二页细胞细胞(xìbāo)破破碎碎 微滤微滤     超超滤滤 发酵结束发酵结束(jiéshù)后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，然后细胞通过高压匀浆机破碎，释放出抗原。

酵母的离，然后细胞通过高压匀浆机破碎，释放出抗原酵母的细胞壁较厚，比大肠杆菌难破碎，可在高压匀浆机内施加细胞壁较厚，比大肠杆菌难破碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压力，通过针形阀突然降压到零，使细胞破碎几千个大气压力，通过针形阀突然降压到零，使细胞破碎在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂以防抗原被分解在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂以防抗原被分解细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解粗细胞裂解物细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解粗细胞裂解物用用0.2um0.2um中空纤维中空纤维(xiānwéi)(xiānwéi)柱进行微滤柱进行微滤抗原和大部分抗原和大部分低分子量宿主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被低分子量宿主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被膜拦截滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子量宿主细胞内含物通过滤膜除去量宿主细胞内含物通过滤膜除去第八页，共十二页疏水柱层析疏水柱层析介质： Butyl S Sepharose FF 加入适量硫酸铵，调节电导率与柱层析平衡液电导率相等按照平衡柱床、上样吸附、平衡液洗柱、降低硫酸铵浓度解析(jiě xī)、清柱再生程序层析阴离子交换柱层析阴离子交换柱层析介质：DEAE  Sepharose  FFHBsAg活性蛋白(dànbái)经Sephadex G-25柱脱盐换液，使缓冲盐系统的PH、离子强度和IEC平衡液一致按照平衡柱床、丄样吸附、氯化钠浓度梯度分段洗脱、清柱再生程序层析凝胶过滤柱层析凝胶过滤柱层析介质：Sepharose 4 FF 超滤浓缩到适当体积按照平衡柱床、丄样、洗脱(xǐ tuō)程序层析第九页，共十二页。

 无菌过滤无菌过滤(guòlǜ)氢氧化铝氢氧化铝(qīnɡ yǎnɡ huà huà)共沉淀共沉淀   分装分装(fēn zhuānɡ)纯化后的抗原再与氢氧化铝共沉淀，纯化后的抗原再与氢氧化铝共沉淀，在共沉淀时，抗原吸附在氢氧化铝在共沉淀时，抗原吸附在氢氧化铝上疫苗的稳定性较差，一般在疫苗的稳定性较差，一般在2~8℃℃下能保存下能保存12个月，个月，但当温度升高后，效力很快降低在但当温度升高后，效力很快降低在37℃℃下，许多疫下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输为了使疫苗的稳定性提高，可用冻干的方法使运输为了使疫苗的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥之干燥收取到的收取到的HBsAg除菌过滤，除菌过滤，即为纯品即为纯品第十页，共十二页临床(lín chuánɡ)(lín chuánɡ)应用•乙肝疫苗自乙肝疫苗自1979年问世以来，经过年问世以来，经过20多年的大规模应用多年的大规模应用和观察，至今尚未见到有关注射后引起严重不良反应的报和观察，至今尚未见到有关注射后引起严重不良反应的报道，只有少数道，只有少数(shǎoshù)人出现接种部位红肿、硬结、疼痛、人出现接种部位红肿、硬结、疼痛、手臂酸重或发热、恶心、呕吐、乏力、皮疹等与一般疫苗手臂酸重或发热、恶心、呕吐、乏力、皮疹等与一般疫苗接种大致相仿的轻微反应，多于接种大致相仿的轻微反应，多于1-3天内不治自愈。

天内不治自愈 由于由于乙肝疫苗属血源性的，在制备过程中纯化与灭活程序十分乙肝疫苗属血源性的，在制备过程中纯化与灭活程序十分严密，故不会产生像破伤风等动物血清疫苗可能造成的过严密，故不会产生像破伤风等动物血清疫苗可能造成的过敏反应，也不会感染上乙肝、艾滋病及其他传染性疾病敏反应，也不会感染上乙肝、艾滋病及其他传染性疾病与其他疫苗同时接种亦未出现相互干扰作用因此，可以与其他疫苗同时接种亦未出现相互干扰作用因此，可以说，乙肝疫苗是安全可靠的预防疫苗，注射前也不必皮试说，乙肝疫苗是安全可靠的预防疫苗，注射前也不必皮试第十一页，共十二页内容(nèiróng)总结乙肝疫苗的制备编码乙型肝炎表面抗原的基因的获取一般的目的基因的获取方法有：①具有准确的转录后修饰(xiūshì)功能 ,表达的糖基化药 物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最 接近于天然蛋白分子细胞破碎→固液分离→浓缩与初步纯化→高度纯化→成品加工为了使疫苗的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥与其他疫苗同时接种亦未出现相互干扰作用第十二页，共十二页。