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显微摄影技术,廖继东 ：02085225841 E-MAIL:,什么是显微摄影？,显微摄影： 利用摄影装置（传统相机、数码相机、专用CCD等）拍摄显微镜视野中所观察到的物像 影像质量取决于： 样本制作质量； 显微镜光学性能； 摄影装置性能； 操作者技术水平内 容,光学显微镜的种类及结构特征 光学显微镜主要光学部件及性能 与显微摄影有关的基本光学概念 显微摄影系统的基本构成 显微摄影基本操作程序 影响显微成像质量的因素,光学显微镜种类及结构特征,按照其光路结构、分辨模式： 正置显微镜 倒置显微镜 体视镜 偏光镜等； 按照其照明光源性质： 可见光（明视场、弱视场） 荧光（紫外、红外）显微镜 激光共聚焦显微镜 光谱显微镜； 按机械部件的控制方式： 手动 电动和全自动显微镜光学显微镜的种类及结构特征,明视场（可见光）照明光源采用普通灯泡或卤素灯，主要用于常规染色组织标本的观察： 组织化学染色样本 免疫组织化学染色样本； 弱视场包括相差（又称相忖）、霍夫曼、微分干涉和偏光等，照明光源与明视场通用，但在光路上插入不同的光学部件，降低背景光强度，增强被观察物体的光反差，提高对透明样本的观察能力，主要用于活组织未染色样本的观察。

光学显微镜的种类及结构特征,荧光显微镜： 照明光源采用汞灯或高能氙灯，通过不同的滤光片组合获得不同波段的激发/发射光，用于荧光染色标本的观察 由于冷光源技术（金属卤素灯）的开发及荧光蛋白技术的日臻成熟，已逐渐克服了强光源对组织的灼伤及活组织荧光显色等技术瓶颈，使荧光显微技术在活组织样本观察中获得了广泛的应用光学显微镜的种类及结构特征,激光共聚焦显微镜： 利用单色高能激光对观测样本进行逐点、多焦面扫描，通过计算机处理合成高清晰图像 光谱显微镜： 采用多滤片组合或分光技术，获得连续激发/发射光谱，用于荧光扫描、荧光萃灭、荧光能量转移等细胞动力学观察,内 容,光学显微镜的种类及结构特征 光学显微镜主要光学部件及性能 与显微摄影有关的基本光学概念 显微摄影系统的基本构成 显微摄影基本操作程序 影响显微成像质量的因素,光学显微镜主要光学部件及性能,透镜及其性能 显微镜成像原理 影响成像的关键因素相差 主要光学部件及性能 光学显微镜相关参数,透镜及其性能,透镜（lens):透镜是由透明物质（如玻璃等）制成的一种光学元件 透镜是折射镜，其折射面是两个球面，或一个球面一个平面它所成的像有实像也有虚像 透镜一般可以分为两大类：凸透镜和凹透镜。

中央部分比边缘部分厚的叫凸透镜，有双凸、平凸、凹凸三种；中央部分比边缘部分薄的叫凹透镜，有双凹、平凹、凸凹三种凸透镜具有会聚光线的作用，所以也叫会聚透镜 凹透镜具有发散光线的作用，所以也叫发散透镜 透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件，物镜、目镜及聚光镜等部件均由单个或多个透镜组成 虚像/实像：光线通过凹透镜后，成正立虚像，而凸透镜则成正立实像实像可在屏幕上显现出来，而虚像不能焦点与焦平面：当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称“焦点”；通过交点并垂直光轴的平面，称“焦平面”焦点有两个，在物方空间的焦点，称“物方焦点”，该处的焦平面，称“物方焦平面”；反之，在像方空间的焦点，称“像方焦点”，该处的焦平面，称“像方焦平面”光学显微镜主要光学部件及性能,透镜及其性能 显微镜的成像原理 影响成像的关键因素相差 主要光学部件及性能 光学显微镜相关参数,显微镜的成像原理,a.当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在像方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实像； b.当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在像方二倍焦距上形成同样大小的倒立实像； c.当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在像方二倍焦距以外形成放大的倒立实像； d.当物体位于透镜物方焦点上时，则像方不能成像； e.当物体位于透镜物方焦点以内时，则像方也无像的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚像。

显微镜的成像原理就是利用上述（c）和（e）的规律把物体放大的当物体处在物镜前F-2F（F为物方焦距）之间，则在物镜像方的二倍焦距以外形成放大的倒立实像在显微镜的设计上，将此像落在目镜的一倍焦距F1之内，使物镜所放大的第一次像（中间像），又被目镜再一次放大，最终在目镜的物方（中间像的同侧）、人眼的明视距离（250mm）处形成放大的直立（相对中间像而言）虚像因此，当我们在镜检时，通过目镜（不另加转换棱镜）看到的像于原物体的像，方向相反光学显微镜主要光学部件及性能,透镜及其性能 显微镜的成像原理 影响成像的关键因素相差 主要光学部件及性能 光学显微镜相关参数,影响成像的关键因素相差,色差（Chromaticaberration）：色差是透镜成像的一个严重缺陷，发生在以多色光为光源的情况下，单色光不产生色差白光由红橙黄绿青蓝紫七种组成，各种光的波长不同，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物方一个点，在像方则可能形成一个色斑色差一般有位置色差，放大率色差位置色差使像在任何位置观察，都带有色斑或晕环，使像模糊不清而放大率色差使像带有彩色边缘球差(Sphericalaberration)：球差是轴上点的单色相差，是由于透镜的球形表面造成的。

球差造成的结果是，一个点成像后，不再是个亮点，而是一个中间亮边缘逐渐模糊的亮斑从而影响成像质量 球差的矫正常利用透镜组合来消除，由于凸、凹透镜的球差是相反的，可选配不同材料的凸凹透镜胶合起来给予消除旧型号显微镜，物镜的球差没有完全矫正，应与相应的补偿目镜配合，才能达到纠正效果一般新型显微镜的球差完全由物镜消除慧差(Coma) ：慧差属轴外点的单色相差轴外物点以大孔径光束成像时，发出的光束通过透镜后，不再相交一点，则一光点的像便会得到一逗点壮，型如慧星，故称“慧差” 像散（Astigmatism）：像散也是影响清晰度的轴外点单色相差当视场很大时，边缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则引起像散像散使原来的物点在成像后变成两个分离并且相互垂直的短线，在理想像平面上综合后，形成一个椭圆形的斑点像散是通过复杂的透镜组合来消除场曲（Curvatureoffield）：场曲又称“像场弯曲”当透镜存在场曲时，整个光束的交点不与理想像点重合，虽然在每个特定点都能得到清晰的像点，但整个像平面则是一个曲面这样在镜检时不能同时看清整个相面，给观察和照相造成困难因此研究用显微镜的物镜一般都是平场物镜，这种物镜已经矫正了场曲。

畸变（Distortion）：前面所说各种相差除场曲外，都影响像的清晰度畸变是另一种性质的相差，光束的同心性不受到破坏因此，不影响像的清晰度，但使像与原物体比，在形状上造成失真光学显微镜主要光学部件及性能,透镜及其性能 显微镜的成像原理 影响成像的关键因素相差 主要光学部件及性能 光学显微镜相关参数,主要光学部件及性能,物镜（objective）:物镜是显微镜最主要的光学部件，显微镜的分辩力主要取决于物镜的数值孔径（镜口率，numerical aperture,NA） 目前常见物镜：消色差物镜、复消色差物镜、半复消色差物镜、平场消色差物镜数值孔径(NA),数值孔径（numerical aperture,NA），是物镜和聚光镜的重要技术参数，是判断光学元件性能的重要标志 它是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率((Eta))和孔径角(u (upsilon))半数的正弦之乘积用公式表示如下：NA=sinu/2消色差物镜（achromatic objective, Ach）这是一种常见的物镜，物镜外壳上不列代表标志物镜把光谱中红蓝光聚焦于一点，黄绿光聚焦于一点，最清晰范围为510630纳米。

这种物镜一般不适宜作摄影用，如加黄绿滤光镜，可获得较为清晰的照片复消色差物镜（apochromatic objective, Apo）这种物镜能把光镜中红、蓝、黄光聚焦于一点，纠正了红蓝光的色差和黄绿光的球差，最佳清晰范围为400720纳米这种物镜适用于在任何色光下或加用各色滤色镜进行观察摄影，适用于彩色摄影但Apo物镜残留有像场弯曲，使平面物体形成类似球面的弯曲影像，结果使视野中心和边缘的影像不能同时聚焦，拍出的底片中心清晰，边缘模糊或者相反半复消色差物镜（荧光石镜，fluorite objective, Fl）最佳清晰范围430680纳米，色差校正介于消色差物镜与复消色差物镜之间 平场消色差物镜(plan achromatic objective, lp)这种物镜纠正了以上三种物镜的缺陷，校正了像场弯曲，不存在视野中心与边缘不能同时准焦的现像由于影像展开，在同样倍数下，影像要比一般物镜的影像大平场消色差物镜有多种类型，外壳上刻有plan.Apo平场复消色差物镜是最佳物镜物镜标识,物镜色差程度：Apo(复消色差物镜) Fl(荧石物镜) plan 或pl(平场消色差物镜) 放大倍数/数字孔径：2.5，4（5），10/0.25，20，40/0.65，63，100/1.25。

标准机械筒长：160mm或170mm 盖玻片厚：0.17mm，常以170mm/0.17mm表示，载玻片厚小于1.2mm 物镜与被检样品的介质：干燥系物镜无标志；油浸镜标有OIL、OEL、HL或IMM字样；水浸镜标为W；甘油为Glyz目镜(eyepiece),目镜是位于实像和肉眼间的放大镜，将物像进行第二次放大，并纠正物镜造成的像差和色差目镜由两片（组）透镜组成，其中，场透镜可使视野边缘的成像光线向内折射，进入眼透镜中，使物体的影像均匀明亮，眼透镜决定放大倍数和成像的优劣目镜筒内装有以金属光阑，物镜放大后的 中间像就落在金属光阑平面处从目镜中透出来的光线在目镜外相交，这个相交点称为眼点（eyepoint）观察时眼睛应在眼点位置上，这样才能接收从目镜射出的全部光线，看到最大的视场，否则会造成图像晃动和不适的感觉，影响观察效果目镜(eyepiece),由前述已知显微镜的分辨能力是由物镜的数字孔径所决定的，而目镜只是起到放大作用因此，对于物镜不能分辩出的细微结构，目镜放得再大，也仍然不能辨认目镜有标准型和广视场型按用途又分为观察目镜、照相目镜和取景目镜照相目镜专供显微照相之用，它是一种负焦目镜，眼点位于目镜内，因而不能用于观察。

它的特点是视场平坦，可校正物镜的残留色差，使投射到感光片（或CCD）上的图像四周与中心都尽可能在一个焦点平面上照相目镜用于显微照相，其放大率不高，一般在2.56.7倍之间照相目镜外侧或端面刻有“PHOTO”、“FK”、“NFK”字样目镜与物镜的组合,显微镜的有效放大率为所用物镜数值孔径的5001000倍目镜与物镜组合前提是使放大倍数在有效放大率范围内 在有效放大率前提下，要提高对物像细节的分辩能力和清晰度，必须使用高数值孔径的物镜和低倍目镜的组合目镜和物镜的组合,当所选目镜的放大倍数低于有效放大倍数时，会造成物镜本来可以辨认的细节因总的放大倍数太小而挤在一起，难以分辩 当所选目镜的放大倍数高于有效放大倍数时，所得放大倍数叫“空的放大”，影像细节的分辩能力没有提高 在有效放大率前提下，要提高对物像细节的分辩能力和清晰度，必须使用高数值孔径的物镜和低倍目镜的组合目镜和物镜的组合,例如数值孔径为1.3的物镜（标记为100/1.3）与放大倍数为4的目镜组合，总放大倍数为400，若入射光为绿色光（550纳米），分辩力为270纳米 数值孔径为0.65的物镜（标记为40/0.65）与放大倍数为10的目镜组合，总放大倍数为400，550纳米时分辩力为500纳米。

两种组合结果，显然第一种能提高物像分辩力不同照像目镜/物镜组合的效果,,照像目镜的选择：在物镜的有效放大倍率内，尽量优选低倍照像目镜聚光器(condenser),聚光器的主要作用是使光线集中于标本，配合物镜提高物像的分辩力。