禽病学实验实习指导书9修订.doc

禽禽病学实验实习指导书编者：陈建红 司兴奎 张济培佛山科学技术学院动物医学系禽病学课程组二0一0年9月修订说明《禽病学实验实习指导书》以佛山科学技术学院原《禽病学实验指导书》为基础，以佛山科学技术学院《禽病学实验教学大纲》（2007版）及《禽病学教学实习大纲》（2007版）为依据作删减修订目前，本实验实习指导书的实验指导部分包括“家禽的尸体剖检及病料采取”、“家禽具有血凝性病毒病的免疫监测”、“鸡白痢与小鹅瘟的血清学诊断”、“鸭疫里默氏杆菌病的实验诊断”4个内容（共8学时）；教学实习指导包括“鸡新城疫的实验诊断”1个内容（18学时）本实验、实习体现了病禽剖检、病料采取、血清学试验、病毒分离鉴定和病原菌分离鉴定等禽病诊断的基本技术，学生能认真操作并结合禽病学相关技术书籍进行学习，将有益于其在禽病学实验技术方面打下必要的基础本指导书适合于兽医专业本科(或专科)禽病学课程实验实习指导，亦适合于兽医工作人员临床操作时参考目 录第一部分 禽病学实验指导实验一 家禽的尸体剖检及病料采取…………………………………………………………实验二 家禽具有血凝性病毒病的免疫监测………………………………………………实验三 鸡白痢与小鹅瘟的血清学诊断……………………………………………………实验四 鸭疫里默氏杆菌病的实验诊断……………………………………………………第二部分 禽病学教学实习指导鸡新城疫的实验诊断…………………………………………………………………………… 第一部分实 验 指 导实验一 家禽的尸体剖检及病料采取一、实验目的掌握家禽尸体剖检、病料采取及病原分离的具体方法。

二、实验内容1．病禽的剖检；2．病料的采取与病原菌的分离三、实验仪器、设备及材料1．剖检病禽的用材：解剖剪、解剖盘、消毒液、洗手盆、毛巾、待检禽等2．病料采取及病原(细菌、病毒或其他微生物)分离的用材：消毒的小剪刀、小镊子、灭菌玻璃容器、研钵、酒精棉、酒精灯、接种棒、培养基及上述剖检用材四、实验原理 1．家禽机体在健康的情况下，各种组织器官具有正常的形态，发病后某些组织器官会发生特征性的变化，通过病禽剖检可以为临床诊断疾病提供依据2．家禽健康的状况下体内不携带病原或毒物，发病后，通过特定的组织器官作病原分离鉴定或对中毒病禽作毒物检测，可以为实验诊断禽病提供可靠的依据 五、实验步骤1．病禽的剖检进行剖检之前，应首先了解发病禽群的流行病学，临床症状情况，家禽的品种，饲养情况，疫苗的接种情况，发病后的经过和处理方法等等剖检时，应注意详细记录各器官的病理变化，如同时剖检多只病死禽，则应注意编号，以免混淆剖检基本术式如下：（1）外貌检查检查天然孔：注意口、鼻、眼(包括眼下方的羽毛是否干燥，若湿润则表明有流泪的可能)有无异常的分泌物，分泌物的量及性状；注意泄殖腔周围羽毛有无异常粪便粘污，泄殖腔粘膜的变化及内容物的性状等。

检查皮肤：注意头、冠、肉髯及身体其他部位的皮肤有无痘疹或结痂等；是否发生腐败；检查家禽的趾爪，注意有无赘生物、外伤、化脓、失水及胫骨有无变软等检查各关节及龙骨：注意各关节有无肿胀、变形及长骨、龙骨有无变形、弯曲等表现检查病禽的营养状态：触摸感觉病禽胸肌厚薄及龙骨的显突情况而初步判定家禽的营养情况2）体腔检查 第一步，用消毒水将禽体羽毛浸湿，防止病原扩散及避免羽毛飞扬 第二步，用剪刀将股内侧连接腹侧的皮肤剪开，将两大腿向外和下方翻压，直至髋关节脱臼，使禽体以背卧位平放于瓷盆上 第三步，横向剪开腹部皮肤，使切口与上述股侧皮肤切口相连，握住游离皮肤，向前一直剥离到锁骨部，检查皮下组织和胸肌的状态横向剪开腹肌、腹膜，并沿胸骨的两侧，向前将各肋骨、锁骨剪断，抓住龙骨的后端，用力向前向上翻拉(此时应注意观察体腔内各气囊壁有无混浊、增厚等)，暴露整个体腔的器官注意体腔有无积液，粘附渗出物及其他异常变化将腺胃、肌胃、心、肝、脾、肺、肠、肾、卵巢、睾丸、法氏囊等各内脏器官先后从体腔摘出作细致检查，先观察外表形态、大小、色泽、质度等变化，再分别切开检查内部变化，注意有无炎性肿胀、充血、郁血、出血、溃疡、坏死或结节等。

3）颈部检查将下颌骨、食道、嗉囊剪开，注意观察口腔和食道粘膜有无出血、溃疡、假膜或脓包等；同时，剥离颈部皮肤检查胸腺(尤其是雏禽)有无出血、萎缩等变化；将小剪刀插入喉头，剪开气管和支气管，检查喉头和气管粘膜有无渗出、充血、出血或溃疡等4）头部检查 第一步，眼部检查主要观察眼的角膜有无异常变化及眼结膜有无出血或溃疡等 第二步，鼻窦部检查沿额面经鼻孔剪开约l～3厘米切口，将切口用手分开即可见鼻窦，观察其有无出血或渗出物的特性 第三步，脑部检查用剪刀将头部皮肤剪开、以尖剪将整个额骨、颅顶骨剪除，暴露大脑和小脑，先观察脑膜血管的状态，脑膜下有无水肿和积液，然后再以钝器轻轻拨离，将前端嗅脑、脑下垂体及视神经交叉等部逐一剪断，将整个大脑和小脑摘出，观察脑实质的变化；（5）神经检查主要检查的神经为坐骨神经干将股内侧的肌肉钝性分开即可见乳白色有横纹的坐骨神经干，观察神经干外膜有无水肿或出血及神经干的粗细是否均匀等6）剖检时的注意事项 ①剖检的场地应尽量远离行人、水源、禽舍，并选择易于消毒的地方，避免由于剖检造成病原扩散 ②剖检前后运载病、死禽只，应采用密封容器，避免沿途遗漏病禽羽毛、分泌物及排泄物等。

③剖检完毕，应将尸体深埋或焚化，或作其他无害化处理对剖检场地及器械要随手洗刷消毒2．病料采取与病原菌(毒)分离家禽传染病的确诊，通常必须过实验室诊断，采取病料与病原分离是实验诊断的前提1）采料时间 病毒性病料、中毒性材料(如肉毒梭菌素中毒)的采取一般应在急性感染期，选择典型的濒死病禽，病前不久用过疫苗或经抗病毒药物处理的禽只不宜采料2）采取病料的方法：①器械消毒：刀、剪：镊子等采料用具可干热灭菌或煮沸30分钟灭菌，注射器等器皿应干热灭菌或高压灭菌②采料部位：病料采取的部位应根据不同疾病相应地采取其脏器或内容物，一般应采取病原含量高而污染机会少的实质性器官，如肝、脑、脾为好在无法估计是何种传染病时，可进行全面采取③各种病料的具体采集方法A．病毒性病料的采取与病毒分离：用灭菌剪刀及镊子剪取含毒量高的组织(通常为肝脏、脑、脾脏、胰脏等实质脏器)2～3克，投入灭菌瓶中，加盖，有条件的地方可即时将病料用灭菌乳钵研磨，并应用超声波或反复冻融法裂解细胞，以利于细胞内病毒的释放，加入5～10倍的灭菌生理盐水或PBS配成悬液，3000~8000转/分钟，离心15~20分钟，去除沉淀，在每毫升上清液中加入青霉素、链霉素(或其他有效抗生素)各2000~4000IU，置4~8ºC冰箱中感作2～4小时。

经无菌检验合格后，接种相应的生物学培养基(禽胚或细胞培养物等)作病毒分离培养，观察感染禽胚死亡及病变情况，收集胚液做进一步鉴定如果病料采取后不能立即处理时，应直接放入低温冰箱或相应保存剂(如Hank's液或50％的甘油PBS)中，并置于冰箱保存B．细菌性病料中病原菌分离：对于各种细菌性疾病，应在病禽剖解前备好相应的培养基对营养要求低的病原菌，如大肠杆菌，可用普通琼脂；对营养要求较高的病原菌，如多杀性巴氏杆菌，可用血液琼脂等；有特殊要求的病原菌，要使用特殊的培养基和方法进行培养，如鸭疫里氏杆菌、鸡副嗜血杆菌等要用巧克力琼脂在含5％～10％CO2的空气条件下培养；怀疑有杂菌污染的病料，应尽量使用需分离细菌的选择性培养基；病原含菌量少时应采用液体培养基，或用相应的增菌培养基增菌培养后，再进行分离培养；未能确定病原菌的种类时，应同时使用多种培养基分离培养，以提高病原菌的分离成功率分离病原菌时，用接种棒直接从病禽体内相应脏器钓取病料在固体培养基上划线培养或液体培养基上接种；如不能即时分离培养，则应以无菌手续采取病料一小块投入无菌的保存剂中，置4~8ºC保存，并应尽早进行分离培养病原菌的分离应在急性发病期和未使用过敏感药物的前提下进行。

C．血清学材料：一般都应采取双相血清，即在发病初期及后期(病愈期)各采取一份，进行检验，以检查有关抗体的变化情况具体方法为：采少量血清时，可用注射器沿向心端的方向从翅静脉直接采取血液；如需大量血清，则可从心脏采血血液先放在经干热灭菌的小瓶或其他容器中自然凝固，待其自然析出血清，再将血清移至灭菌容器中冻结保存备用血清若有溶血则会影响试验结果的准确性D．组织学材料的采取：供病理组织切片的材料，应将病禽典型病变部分及其相连的健康组织一并切取，随即投入10%甲醛中固定备用E．肠道内容物材料的采取：用棉线将决定采取内容的肠道两端扎紧，然后剪下置于灭菌容器中，必要时可放入20ºC保存，并迅速送检不论上述哪一种材料，都不应该在死后过长时间(一般不超过死后4～6小时)采取，否则会对正确的诊断造成一定的影响所有病料采取后均要贴上标签若要送检时，还要用医用胶布或石蜡封口，置于冰瓶中及时送出六、实验报告要求1．扼要地反映病禽剖检与病料采取的基本程序2．说明操作的注意事项 3．陈述实验体会七、实验的注意事项(参阅实验步骤)八、思考题家禽尸体剖检、病料采取及病原分离的方法与注意事项如何?实 验 二 家禽具血凝性病毒病的免疫监测一、实验目的1.掌握血凝性病毒病免疫监测的基本方法。

2.学会根据血凝性病毒病免疫监测的结果指导鸡群血凝性病毒病免疫接种二、实验内容 1.红细胞凝集试验－检测抗原的HA效价及4个血凝单位抗原的配制2.红细胞凝集抑制试验－检测免疫禽只的HI抗体3.根据血凝性病毒病免疫监测的结果指导鸡群相应病毒病的免疫接种三、实验仪器、设备及材料1.抗原原液：购自标准厂家，根据监测抗体的种类而确定抗原的种类ND免疫监测―ND抗原；AI H5免疫监测―H5抗原；AI H9免疫监测―H9抗原；EDS－76免疫监测―EDS抗原2.被检血清：随机采取被检禽群的血液（抽样比例约为1％～2％，或每个禽群抽取20～40只），取血液自然凝固后析出的血清作为被检血清3.灭菌PBS生理盐水，PH7.0，按常规配制4.红细胞悬浮液：采取健康公禽（被检测血清为鸡血清时，应采用公鸡，被检血清为鸭、鹅血清时，应采用公鸭）血液（每次可采5～10mL），抗凝，加灭菌PBS生理盐水离心洗涤3～5次（每次离心的速度和时间为3000转/分钟，15分钟，将血浆、白细胞等充分洗去，将沉淀的红细胞用灭菌PBS生理盐水稀释成1％悬浮液该红细胞悬浮液在4℃存放，可用3～5天注意悬浮液颜色变暗应予弃去。

5.其他材料：25uL移液器，96孔V型反应板，普通离心机等以下内容主要以ND的免疫监测为例，同学们可依此类推探讨其他血凝性病毒病免疫监测的相关技术）四、实验原理鸡群ND免疫后，体内可产生抗ND中和抗体及红细胞凝集抑制抗体（HI抗体）后者在体外可抑制NDV凝集红细胞的能力在一系列试管中，将被检鸡血清作连续稀释，血清中HI抗体越高，则能使ND病毒凝集红细胞能力完全抑制的血清稀释度就越高由于HI抗体与中和抗体的。