药用石斛内生菌的研究进展.docx

    药用石斛内生菌的研究进展    王珊珊 刘佳萌 孙晶 贾宁 范蓓 戴小枫摘 要：综述了药用石斛内生菌的分离鉴定以及与宿主互作关系等方面的国内外研究进展在介绍药用石斛内生真菌、内生细菌的基础上，结合本课题组前期对石斛内生细菌做出的相关研究工作，对其研究发展思路进行了展望，为开发安全有效的微生物菌肥、中医药产品、新资源功能性食品，合理利用药用石斛资源提供科学依据Key：药用石斛;内生真菌;内生细菌石斛（Dendrobium）属兰科植物，全球现存约1 500种，其中仅中国华南及西南地区就分布有近80种石斛不仅闻名于其较好的观赏性，许多种类还具有极高的药用价值，中国石斛属植物已超过50余种被认定为有药用价值[1]本文将药典里已有明确规定用作药用、传统用作药用、相关研究证明具有药用疗效的石斛统称为药用石斛在我国传统医学中，石斛属多种植物的新鲜或干燥茎被收做药用，具有极高的药用价值，如铁皮石斛（Dendrobium offcinale）、霍山石斛（Dendrobium huoshanense）、金钗石斛（Dendrobium nobile）和流苏石斛（Dendrobium fimbriatum）等[2]。

《神农本草经》最早对石斛记录其 “味甘，平主伤中;除痹，下气，补五脏虚劳羸瘦，强阴久服厚肠胃;轻身延年”，其被历代医家视为珍品，民间甚至称其为 “九大仙草”之一[3]据2015版《中国药典》记载，石斛味甘，微寒;归胃、肾经益胃生津，滋阴清热，用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软[4]现代医学的大量研究表明，石斛中含有丰富的氨基酸、生物碱、多糖、酚类等活性成分，具有很好的降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、提高免疫等功效[5]研究表明，药用植物与众不同的次级活性代谢物极有可能与其相关微生物群落的高特异性有关[6]一些从药用植物中分离出的特定内生菌可产生与宿主植物相同或相似的活性功能，或者对药用植物的一些致病菌具有较好的抑制效果[7-8]国内外研究人员在药用石斛内生菌的分离鉴定以及与宿主互作关系等方面已作了一些相关的研究药用石斛在其生活史中与内生菌经过长期的协同进化，彼此构成了稳定的生态关系药用石斛内生菌分泌的次级活性代谢物会对石斛的生长发育产生刺激作用，进而提高宿主石斛对生物胁迫以及非生物胁迫的抵抗能力;与此同时，内生菌也可从宿主石斛中吸取养分以供自身生长所需。

本文对药用石斛内生菌进行综述，为开发出安全有效的微生物菌肥、中医药产品、新资源功能性食品，合理的利用宝贵药用石斛资源提供科学依据，并针对该领域存在的主要问题提出解决方案1 药用石斛内生真菌1.1 药用石斛内生真菌研究概况近年来，内生真菌因其较为丰富的生物组成多样性及次生代谢产物多样性，已成为寻找具有生物活性成分的重要来源，并引起众多研究者的关注目前，已有对以下药用石斛内生真菌进行研究的报道：铁皮石斛（Dendrobium offcinale）、霍山石斛（Dendrobium huoshanense）、美花石斛（Dendrobium loddigesii）、金钗石斛（Dendrobium nobile）、细茎石斛（Dendrobium moniliforme）、齿瓣石斛（Dendrobium devonianum）、束花石斛（Dendrobium chrysanthum）、流苏石斛（Dendrobium fimbriatum）和华石斛（Dendrobium sinense）等少数具有较高经济价值的种类其他品种石斛涉及较少，对内生真菌与宿主石斛互作机理的研究也鲜有报道[9-18]药用石斛内生真菌的种群存在丰富的多样性，其主要分为三大门类：子囊菌亚门（Ascomycota）、担子菌亚门（Basidiomycotina）和半知菌亚门（Deuteromycotina），包括炭角菌科（Xylariaceae）、伞菌科（Agaricaceae）以及丛梗孢科（Moniliaceae）等约25个科，小菇属（Mycena）、木霉属（Trichoderma）以及柱孢霉属（Cylindrocarpon）等约57个属[19-21]。

虽然已经分离鉴定出的药用石斛内生真菌种类相对较多，但对比于丰富的药用石斛资源来说，内生真菌多样性的研究还远远不够药用石斛内生真菌在宿主中的分布存在特异性前人研究表明，药用石斛内生真菌的分布受组织、宿主、环境等因素的影响，进而体现出一定的组织、宿主、生境特异性洪群艳等 [22]通过组织分离法对从云南采集到的8种野生石斛中的内生真菌进行分离、鉴定以及分布组成研究，结果发现，不同种的石斛内生真菌分布情况具有较大差异，呈现出一定的宿主特异性;根、茎、叶中内生真菌的分布差异性也极其显著，说明内生真菌定殖具有组织特异性毛益婷等[23]对采集自湖南省新宁县崀山、广西省乐业县雅长两个不同生境下，相同生长期铁皮石斛根组织中的内生真菌进行分离、鉴定，结果表明，雅长野生铁皮石斛内生真菌多样性明显高于崀山其中，胶膜菌属（Tulasnella）和柱孢霉属（Cylindrosporium）为崀山所特有，拟盘多孢霉（Pestalotiopsis）為雅长所特有由此可见，不同生境下野生铁皮石斛内生真菌的多样性存在一定的特异性陈玉栋等[24]、胡克兴等[25]、董飞[26]研究表明，铁皮石斛根部和茎部的内生真菌丰富度要明显高于叶片，特别是在根中内生真菌资源最为丰富。

陈晓梅等[10]研究表明，美花石斛根部内生真菌多样性明显高于茎和叶，此结果与铁皮石斛相一致然而，柴晓蕾等[11]对海南华石斛野生植株内生真菌的研究结果表明，叶中分离出的菌株数最多由此可见，不同品种的药用石斛内生真菌的分布以及数量存在一定的差异性，也或是因为目前多采用组织分离法进行内生真菌的分离，其中的分离培养基、消毒程序、人为操作、培养条件等因素也会造成菌株分离结果的差异内生真菌与宿主的互作关系研究甚少，尚不明朗，多为推论性或间接性的结果因此，在未来的药用石斛内生真菌的研究中，可通过结合高通量测序等DNA分析技术，例如构建不同品种药用石斛内生真菌的cDNA文库等，快速筛选内生真菌1.2 研究药用石斛内生真菌的重要性1.2.1 内生真菌对药用石斛种子萌发以及植株生长的影响 现有研究表明，内生真菌在药用石斛的生长发育和系统演化过程中起着至关重要的作用黄晖等[9]采用单菌丝团分离法对齿瓣石斛根组织中的内生真菌进行分离、鉴定，共得到内生真菌6株，将其分别与齿瓣石斛无菌幼苗共生培养结果发现，FDdS-5菌株对幼苗株高、干重、鲜重、根数和茎粗都表现出显著的促进效果，FDdS-9菌株只对无菌苗的株高具有显著的促进作用。

随后，孟娉等[27]利用注射器接种法分别将上述两种菌株的单一菌剂以及混合菌剂注射接种到松树皮基质上与铁皮石斛幼苗进行共生培养，结果表明，FDdS-5和FDdS-9均能对铁皮石斛幼苗生长表现出显著的促进作用同时，混合菌剂接种组与单菌株接种组相比，对石斛幼苗生长的协同效应更加明显由此可见，齿瓣石斛的促生真菌同样能对铁皮石斛幼苗的生长具有促进作用，混合接种可能会更大地发挥微生物的效能近几年来，已有相关研究陆续报道了内生真菌对铁皮石斛、金钗石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛、华石斛、霍山石斛、美花石斛和细茎石斛等具有促生作用[17，28-31]关于药用石斛内生真菌对宿主的促生机制已有相关的研究报道马昭[32]初步研究了具有促生作用的内生真菌对铁皮石斛转录水平的影响，发现内生真菌感染铁皮石斛无菌苗后宿主植物在一系列代谢途径上均发生了基因差异表达其中，NT66G01、NT04Y01两菌株具有使宿主植物生长相关代谢通路基因表达明显上调的作用X B Xu等[33]利用二维电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定了与石斛小菇共生栽培的铁皮石斛根系蛋白，共鉴定出41种被石斛小菇诱导产生的蛋白质。

其中，10种参与了植株的防御和应激反应、2种参与了根系的形成、3种参与了宿主植物活性成分的生物合成赵英梅[34]对石斛小菇侵染金钗石斛前后基因水平的变化进行了初步探索，发现CI-通道蛋白、生长素跨膜蛋白、肽合成酶合成代谢途径的一些重要基因，比如Unigene65712、Unigene65407、Unigene68656等上调倍数达到15倍以上，推测可能参与了石斛菌根的建立过程虽然已有大量研究表明，药用石斛内生真菌能促进宿主植株的种子萌发和幼苗生长，但还需要研究者对药用石斛与内生真菌之间的共生机理研究透彻，以便为开发出绿色安全的微生物菌肥以及药用石斛的仿生态栽培提供理论技术支持，从而更好地利用宝贵的药用石斛资源1.2.2 内生真菌对药用石斛化学成分和药理活性的影响 自Stierle A等[35]从植物内生真菌中发现抗癌药物紫杉醇以来，内生真菌作为一种新的天然产物和生物活性物质的重要来源而备受关注研究表明，内生真菌在与药用石斛互相依存的过程中，会对药用石斛的化学成分以及药理活性产生一定的影响内生真菌对药用石斛化学成分和药理活性的影响主要从以下两种途径进行：（1）内生真菌可刺激宿主植物的代谢活动，进而提高其次级代谢产物的含量，增强其药用效果。

陈晓梅等[36]研究表明，在内生真菌与金钗石斛共生培养条件下，不仅能促进金钗石斛的生长，而且还能提高金钗石斛总生物碱和多糖的含量罗在柒等[37]测定了3株内生真菌的分泌物对金钗石斛超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和氧化物酶（POD）活性的影响，结果发现，这3株内生真菌分泌物均能诱导金钗石斛的酶活性增强赵英梅[34]在对石斛内生真菌互作分子机理的研究中发现，其共生体系能促进金钗石斛组培苗生物量的积累2）内生真菌自身或可产生与宿主植物相同或相似的药用活性产物Sujit Shah等[17]对从细茎石斛中分离出的内生真菌进行研究发现，R10能产生相对较高的吲哚乙酸（IAA）同时，利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）在R11和R6的有机提取物中观察到酚类化合物和挥发油的存在，推测它们或许对寄主植物的抗菌和抗氧化性具有一定的影响1.2.3 药用石斛内生真菌的抗菌活性 已有相关研究表明，药用石斛内生真菌对一些石斛病原菌具有很好的抑制效果，是获取天然抗菌活性物质的有效途径张丽春等[38]从5 种云南产石斛属植物中分离得到内生真菌155 株，其中48 株真菌對枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等6种病原菌中的至少1种具有抑制效果。

周琢艳等[39]通过抑菌实验发现，分离自铁皮石斛的28 株内生真菌中，有7 株能对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的至少1 种表现出抗菌活性，其代谢产物的醋酸乙酯萃取相对3种指示菌及人肝癌细胞HepG2具有不同程度的抑制效果除此之外，还有不少研究已证实，从药用石斛植物中分离得到的内生真菌对多种病原菌呈现出良好的抗菌活性[11，26，30，40]尽管这些内生真菌的抗菌活性成分以及作用机制尚不明确，但不可否认的是，这为今后获得天然抗菌活性物质和研发新型抗生素药物提供了宝贵的真菌资源1.2.4 药用石斛内生真菌的其他作用 随着现代科学研究技术的发展，对于药用石斛内生真菌的研究已扩展到了其他各个研究领域，内生真菌的作用也正在被一步步挖掘出来刘小莉等[41]从石斛中分离得到一株内生禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）DO-1，其菌体在去离子水中浸泡后分泌的代谢产物与硝酸银作用后，能还原银离子产生具有抗菌作用的纳米银粒子相子春[42]对从药用植物铁皮石斛根组织中分离出的一株瘤菌根菌属（Epulorhiza sp.）真菌M1进行细胞毒理性实验，发现其可以显著降低感染细胞内的HIV-1 RNA含量，且M1对H。