3将愈伤组织在液体培养基中培养.ppt

项目十一项目十一细胞培养细胞培养教学目标教学目标工作任务工作任务实践操作实践操作问题探究问题探究知识拓展知识拓展作作 业业教学内容教学内容教学终极目标教学终极目标促促 成成 目目 标标教学目标教学目标工作任务工作任务液体振荡培养愈伤组织液体振荡培养愈伤组织 任务任务3将天蓝苜蓿的种子消毒，接种到培养基上诱导无菌苗将天蓝苜蓿的种子消毒，接种到培养基上诱导无菌苗任务任务1收集单细胞，并调节细胞密度收集单细胞，并调节细胞密度 任务任务4培养单细胞使其形成愈伤组织培养单细胞使其形成愈伤组织 任务任务5 切取无菌苗下胚轴，诱导愈伤组织切取无菌苗下胚轴，诱导愈伤组织 任务任务2进行愈伤组织增殖、分化培养进行愈伤组织增殖、分化培养 任务任务6分化出的小苗进行生根培养分化出的小苗进行生根培养 任务任务7项目介绍 指对从指对从植物器官植物器官或由或由愈伤组织愈伤组织上分离的单细胞（或小细上分离的单细胞（或小细胞团）进行培养，形成胞团）进行培养，形成单细胞无性系单细胞无性系或或再生植株再生植株的技术植物细胞培养Haberlandt：高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞首次进行离体细胞培养首次进行离体细胞培养小野芝麻、凤眼兰的栅栏细胞和小野芝麻、凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞虎眼万年青属表皮细胞 利用植物细胞培养可以获得植物有用的利用植物细胞培养可以获得植物有用的代谢产物，也可以进行突变体的诱导和选择，还代谢产物，也可以进行突变体的诱导和选择，还可以对植物的生理生化进行研究。

本项目以天蓝可以对植物的生理生化进行研究本项目以天蓝苜蓿为材料，阐述了细胞培养的技术苜蓿为材料，阐述了细胞培养的技术 一、天蓝苜宿愈伤组织诱导一、天蓝苜宿愈伤组织诱导 用浓硫酸浸泡种子用浓硫酸浸泡种子5min5min后，再用后，再用0.1%0.1%升汞溶液灭菌升汞溶液灭菌3min3min无菌水冲洗无菌水冲洗4 4次后，将种子接种在不含激素的次后，将种子接种在不含激素的固体固体MSMS培养基上种子萌发培养基上种子萌发3 3天后切取子叶和胚轴天后切取子叶和胚轴外植体切成外植体切成1 1～～2mm2mm的切段，接种在培养基上诱导愈的切段，接种在培养基上诱导愈伤组织愈伤组织诱导在暗培养中进行，温度为伤组织愈伤组织诱导在暗培养中进行，温度为2727±±1℃1℃ 实践知识 当子叶和胚轴外植体诱导出的愈伤组织长到当子叶和胚轴外植体诱导出的愈伤组织长到5mm5mm大小时，转入液体培养基中进行旋转式振荡培养大小时，转入液体培养基中进行旋转式振荡培养(120r/min)(120r/min)每周换液一次每周换液一次 培养四周后，用培养四周后，用400400门镍丝网过滤悬浮细胞液，门镍丝网过滤悬浮细胞液，倒置显微镜下检查和统计不同细胞系的细胞密度。

倒置显微镜下检查和统计不同细胞系的细胞密度过滤后的悬浮细胞液静置过滤后的悬浮细胞液静置1 1小时，待细胞完全沉淀后，小时，待细胞完全沉淀后，倒掉上清液，加入培养基将细胞悬浮液的细胞密度倒掉上清液，加入培养基将细胞悬浮液的细胞密度调到调到104104个个/ml/ml二、单细胞分离和收集单细胞培养单细胞培养分离的单细胞分离的单细胞看护培养看护培养微室培养微室培养平板培养平板培养单细胞无性系单细胞无性系制备单细胞制备单细胞: :细胞分离细胞分离获得单细胞的途径获得单细胞的途径由完整的植物器官分离单细胞由完整的植物器官分离单细胞由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞叶片是分离单细胞的最好材料叶片是分离单细胞的最好材料 叶片叶片愈伤组愈伤组织织l愈伤组织或悬浮培养物愈伤组织或悬浮培养物( (常常) ); ;l用用纤维素酶和果胶酸酶纤维素酶和果胶酸酶从组织分离从组织分离l机械法机械法利用机械的方法使叶肉细胞得到分离的技术利用机械的方法使叶肉细胞得到分离的技术 ⑴⑴撕去叶表皮，暴露叶肉细胞，然后用解剖刀把细胞刮下来撕去叶表皮，暴露叶肉细胞，然后用解剖刀把细胞刮下来, ,离体细离体细胞可直接种在液体培养基中培养。

胞可直接种在液体培养基中培养⑵⑵先将叶片组织轻轻研碎，再通过过滤和离心将细胞纯化先将叶片组织轻轻研碎，再通过过滤和离心将细胞纯化. . 研钵中放入研钵中放入10g10g叶片和叶片和40ml40ml介质（介质（2020µ µmolmol蔗糖，蔗糖，1010µ µmolMgCl2molMgCl2、，、，2020µ µmol mol Tris-HClTris-HCl缓冲液，缓冲液，pH7.8pH7.8）轻轻研磨，然后将匀浆用两层）轻轻研磨，然后将匀浆用两层细纱布过滤，滤液经低速离心，使游离细胞沉降到试管的底部，细纱布过滤，滤液经低速离心，使游离细胞沉降到试管的底部，得到纯化的细胞得到纯化的细胞 液体培养液体培养说明：说明：只有薄壁组织排列松散、细胞间接触面很小时，只有薄壁组织排列松散、细胞间接触面很小时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功用机械法分离叶肉细胞才能取得成功 机械法用用纤维素酶和果胶酸酶纤维素酶和果胶酸酶从组织分离从组织分离利用利用纤维素酶纤维素酶果胶酶使细胞间的中胶层发生降果胶酶使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞的技术解，分离出具有代谢活性的细胞的技术。

•酶解法的特点：酶解法的特点：•能得到比较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞能得到比较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞•但在使用该法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护但在使用该法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护, 防止细胞的胀裂防止细胞的胀裂液体培养液体培养酶解法注意：注意：大麦、小麦和玉米，很难通过酶解法使细胞分离因大麦、小麦和玉米，很难通过酶解法使细胞分离因为叶肉细胞较长，并在许多地方收缩，细胞间有链状互锁结为叶肉细胞较长，并在许多地方收缩，细胞间有链状互锁结构阻止细胞的分离构阻止细胞的分离机械法和酶解法比较机械法和酶解法比较机械法：机械法：1 1、细胞不会受到酶的伤害；、细胞不会受到酶的伤害；2 2、质壁不会分离；、质壁不会分离；3 3、细胞产量低；、细胞产量低；4 4、细胞易破坏细胞易破坏 酶解法：酶解法： 1 1、细胞会受到酶的伤害；、细胞会受到酶的伤害； 2 2、质壁可能分离；、质壁可能分离； 3 3、细胞产量高；、细胞产量高； 4 4、细胞不易破坏细胞不易破坏小麦 把未分化和易散碎的愈伤组织转移到装有液体把未分化和易散碎的愈伤组织转移到装有液体把未分化和易散碎的愈伤组织转移到装有液体把未分化和易散碎的愈伤组织转移到装有液体培养基的三角瓶内，将这些悬浮培养物在摇床上培养基的三角瓶内，将这些悬浮培养物在摇床上培养基的三角瓶内，将这些悬浮培养物在摇床上培养基的三角瓶内，将这些悬浮培养物在摇床上进行振荡培养，并得到游离细胞。

进行振荡培养，并得到游离细胞进行振荡培养，并得到游离细胞进行振荡培养，并得到游离细胞悬浮悬浮振荡培养振荡培养1 1）） 诱导产生愈伤组织；诱导产生愈伤组织；2 2）） 愈伤组织反复继代，使组织不断愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织松散性；增殖，提高愈伤组织松散性；3 3）将愈伤组织在液体培养基中培养，）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物建立悬浮培养物. .茎段茎段愈伤组织或悬浮培养物愈伤组织或悬浮培养物( (常常) )优点：优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流匀分布；有空气交流振荡的作用：振荡的作用： ⑴ ⑴对细胞团施加一定的压力，使之破碎对细胞团施加一定的压力，使之破碎成小细胞团或单细胞成小细胞团或单细胞 ⑵ ⑵促进培养基和容器内空气之间气体交促进培养基和容器内空气之间气体交换，保证细胞正常代谢换，保证细胞正常代谢 取取5ml5ml悬浮细胞液置于直径悬浮细胞液置于直径5cm5cm的玻璃培养皿的玻璃培养皿中进行静止的浅层液体培养培养皿置于培养箱中进行静止的浅层液体培养。

培养皿置于培养箱中进行暗培养，温度为中进行暗培养，温度为2727士士1℃1℃每隔1010天加入天加入2 2～～3ml3ml新鲜培养基当愈伤组织长到新鲜培养基当愈伤组织长到1 1～～2mm2mm时，统时，统计每个培养皿中形成愈伤组织块的数量，并将愈计每个培养皿中形成愈伤组织块的数量，并将愈伤组织转入固体培养基上进行增殖当愈伤组织伤组织转入固体培养基上进行增殖当愈伤组织增殖到增殖到4 4～～5mm5mm时，培养基上进行时，培养基上进行分化培养分化培养 三、单细胞培养单细胞培养方法单细胞培养方法看护培养法看护培养法微室培养法微室培养法固体平板培养法固体平板培养法液体浅层培养法液体浅层培养法平板培养法平板培养法￿单细胞培养方法用途用途：诱导形成单细胞系诱导形成单细胞系含义含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法并使其生长和增殖的方法 看护培养的含义及用途看护培养的含义及用途用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养细胞用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养细胞的一种方法的一种方法就是把单细胞放在一块活跃生长的愈伤组织上进行培养，就是把单细胞放在一块活跃生长的愈伤组织上进行培养，在愈伤组织在愈伤组织和培养的细胞之间有一层滤纸相隔。

和培养的细胞之间有一层滤纸相隔 （一）、看护培养法（（1 1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用2 2）在无菌条件下，将一小块（）在无菌条件下，将一小块（1cm1cm3 3）活跃生长的愈伤组织）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm1cm² ²））已灭已灭菌的滤纸，放置一晚上菌的滤纸，放置一晚上3 3）将分离的单细胞接种到培养基的滤纸上将分离的单细胞接种到培养基的滤纸上4 4）恒温培养恒温培养看护培养基本技术看护培养图示：Nurse callusFilter paperSingle cell单细胞无性系单细胞无性系恒温培养恒温培养1个月个月2~3月月用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖这个愈伤组织称块为其生长和增殖这个愈伤组织称块为看护愈伤组织看护愈伤组织优点：优点：（（1 1）简便易行简便易行2 2）效果好，易于成功效果好，易于成功缺点：缺点：（（1 1）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。

不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程3、看护培养特点： 离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养则分裂离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养则分裂的原因：的原因： 看护愈伤组织给单细胞提供了培养基的营养成分和促进看护愈伤组织给单细胞提供了培养基的营养成分和促进细胞分裂的其它活性物质细胞分裂的其它活性物质1 1 微室培养的含义及用途微室培养的含义及用途用途用途: :主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程含义含义: :将单细胞培养人工制造的一个小室中（少量的培养将单细胞培养人工制造的一个小室中（少量的培养基中）进行培养基中）进行培养二）、微室培养法微室培养图示：1滴含单细胞培养液滴含单细胞培养液周围加石蜡油周围加石蜡油凹穴载凹穴载玻片玻片旁边加石蜡油旁边加石蜡油盖盖玻片盖盖玻片盖盖玻片盖盖玻片平视图平视图置培养皿中置培养皿中26~28 ℃℃恒恒温培养温培养微室培养要求：微室培养要求：  微室内不能有气泡微室内不能有气泡  微室的厚度最好不要超过微室的厚度最好不要超过2020微米，微米，盖玻片的厚度要在盖玻片的厚度要在0.17-0.18mm0.17-0.18mm左右。

左右  观察时要保持温度和培养时一致观察时要保持温度和培养时一致2￿￿￿微室培养特点：优点：优点： （（1 1））在培养过程中，可以连续进行显微在培养过程中，可以连续进行显微观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程全部过程缺点：缺点： （（1 1）培养时间较短）培养时间较短1 1、含义及用途：、含义及用途： 含义含义: :将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法三）、平板培养法2 2、特点、特点优点：优点：（（1 1）可以定点观察；）可以定点观察；（（2 2）分离单细胞系容易；）分离单细胞系容易；缺点：缺点：（（1 1）培养细胞气体交换不畅培养细胞气体交换不畅 用途用途: :分离单细胞无性系，研究其生理、生化、分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术广遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。

 ( (1)1)、悬浮细胞密度的调制、悬浮细胞密度的调制 平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为为1 1××10 10 ³ ³ - -100100××10 10 ³ ³ 个个/ml/ml 3￿￿￿平板培养的基本技术初始植板密度：初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度A A. .直接配制直接配制1.4%1.4%琼脂基本培养基琼脂基本培养基B.1.4%B.1.4%琼脂基本培养基琼脂基本培养基+ +等量细胞培养液等量细胞培养液=0.7 % =0.7 % 琼脂条件培养基琼脂条件培养基2）培养基配制（（3 3））制平板制平板：：细胞悬浮液与融化状态（细胞悬浮液与融化状态（35 ℃ 35 ℃ ）） 条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板4)(4)培养：培养： 26℃26℃置暗处培养置暗处培养2121天低倍显微镜观察，天低倍显微镜观察，记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。

小细胞团计数方法：小细胞团计数方法：1 1）低倍显微镜直接计算；）低倍显微镜直接计算；2 2）细胞团显影法）细胞团显影法植板效率（或植板率）：植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数已形成细胞团的百分数（即每（即每100100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出小细胞个铺在平板上的细胞中有多少个能长出小细胞团）显影仪显影仪平板培养应注意的问题：平板培养应注意的问题：（（1 1）选用的培养基必须是能够在低的细胞起始密度下使）选用的培养基必须是能够在低的细胞起始密度下使细胞生长细胞生长2 2）不要选用处在静止期过久的细胞不要选用处在静止期过久的细胞3 3）在固体培养基中适宜的起始密度因植物种类而不同在固体培养基中适宜的起始密度因植物种类而不同如：烟草细胞适宜的为如：烟草细胞适宜的为5-105-10××10103 3/ml/ml（（4 4）接种时固体）接种时固体培养基的温度要严格控制，一般不超过培养基的温度要严格控制，一般不超过35 ℃35 ℃，温度低，温度低对细胞伤害小，但操作困难，凝固快会造成细胞分布不对细胞伤害小，但操作困难，凝固快会造成细胞分布不均  条件培养基培养条件培养基培养 在培养基中加入高密度的细胞进行液体培养，一定时间后这些细在培养基中加入高密度的细胞进行液体培养，一定时间后这些细胞就会向培养基中胞就会向培养基中分泌一些物质分泌一些物质，过滤掉其中的细胞，将这种这，过滤掉其中的细胞，将这种这种培养基再制成液体或固体培养基来培养单细胞或细胞团，这样种培养基再制成液体或固体培养基来培养单细胞或细胞团，这样可明显提高单细胞培养物的存活和分裂的能力。

可明显提高单细胞培养物的存活和分裂的能力 液体浅层培养液体浅层培养 将悬浮培养液中的细胞过滤，得到游离单细胞和小细胞团将悬浮培养液中的细胞过滤，得到游离单细胞和小细胞团 在浅层液体培养基中培养在浅层液体培养基中培养 用途：主要用来增殖细胞用途：主要用来增殖细胞 特点：特点：有利于有毒物质的扩散；有利于气体交换；不利于定点观察；有利于有毒物质的扩散；有利于气体交换；不利于定点观察；单细胞生长、分裂后，难以得到单单细胞生长、分裂后，难以得到单   细胞系条件培养基：条件培养基：曾悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基曾悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基培养细胞的计数和活力测定如何进行？培养细胞的计数和活力测定如何进行？（一）原理（一）原理 1.1.计算细胞数目计算细胞数目 可用血球计数盘或是可用血球计数盘或是Coulter counter Coulter counter 粒子计数器自粒子计数器自动计数 2.2.血球计数盘血球计数盘 一般有二个一般有二个chamberschambers，每个，每个chamber chamber 中细刻中细刻9 9个个1mm2 1mm2 大正方形，大正方形， 其中其中4 4个角落之正方形再细刻个角落之正方形再细刻1616个小格，深度个小格，深度均为均为0.1 mm0.1 mm。

当当chamberchamber上方上方 盖上盖玻片后，每个大正方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为形之体积为1mm2x0.1mm=1.0x101mm2x0.1mm=1.0x10-4-4mlml使用时，计数每个大使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以10104 4，即为，即为每每mlml中之细胞数目中之细胞数目 问题探究 3.3.存活测试原理存活测试原理 是利用染料会渗入死细胞中而显色，而活细是利用染料会渗入死细胞中而显色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会显色来测胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会显色来测定活力的一般使用蓝色之定活力的一般使用蓝色之trypantrypan blue blue 染料，染料，如果细胞不易吸收如果细胞不易吸收trypantrypan blue blue，则用红色，则用红色ErythrosinErythrosin bluish bluish 1 1、条件培养基、条件培养基2 2、细胞密度、细胞密度( (> >临界密度临界密度) )3 3、生长激素、生长激素4 4、、pHpH5 5、、CO2CO2影响单细胞培养的因子影响单细胞培养的因子问题探究细胞悬浮培养（细胞悬浮培养（Suspension culture)Suspension culture)含义及特点含义及特点2 2、、特点特点（（1 1）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；规模培养；（（2 2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。

分化创造方法和条件1 1、、含义：含义：将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养无菌培养相关阅读一、悬浮培养类型和方法连续培养连续培养成批培养成批培养注：悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团注：悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团起始悬浮液的制备起始悬浮液的制备 愈伤组织愈伤组织 液体培养基液体培养基 摇床振荡摇床振荡   转速转速30-150rpm 2-3cm30-150rpm 2-3cm冲程防细胞破裂冲程防细胞破裂 悬浮培养悬浮培养 要求：质地疏松，细胞分散程度大要求：质地疏松，细胞分散程度大 （质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养）（质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养）（一）成批培养（一）成批培养/ /分批培养（分批培养（Batch cultureBatch culture））含义：含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培养它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用养它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法的培养方法（（1 1））培养基体积固定；培养基体积固定；（（2 2）必须适当搅拌；）必须适当搅拌；（（3 3）培养过程中，细胞生长，其数目不断）培养过程中，细胞生长，其数目不断 发生变化，呈发生变化，呈S S增长；增长；（（4 4）但要进行下一批培养，则生长一定时）但要进行下一批培养，则生长一定时 间后，需要继代转移。

间后，需要继代转移 2 2、成批培养的方法、成批培养的方法(1)(1)旋转培养旋转培养(2)(2)往返震荡培养往返震荡培养(3)(3)旋转震荡培养旋转震荡培养(4)(4)搅动培养搅动培养1、成批培养特点培养时间培养时间培培养养细细胞胞数数目目12345延迟期延迟期对数生长期对数生长期直线生长期直线生长期缓慢期缓慢期静止期静止期12345细胞生长曲线细胞生长曲线①①延滞期延滞期：细胞很少分裂，细胞：细胞很少分裂，细胞数目增加少数目增加少②②对数生长期对数生长期：细胞分裂活跃，：细胞分裂活跃，数目迅速增加数目迅速增加③③直线生长期直线生长期：细胞增殖最快时：细胞增殖最快时期，单位时间内细胞数目增长大期，单位时间内细胞数目增长大致恒定致恒定, , 细胞数目达到最高峰细胞数目达到最高峰④④缓慢期缓慢期：培养基中某些营养物：培养基中某些营养物耗尽，或是有毒代谢物的积累，耗尽，或是有毒代谢物的积累，增长速度逐渐变慢增长速度逐渐变慢⑤⑤静止期静止期生长趋于完全停止生长趋于完全停止（二）连续培养含义：含义：指在培养过程中，以不断抽取悬浮指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。

养（（1 1））新鲜培养基的不断加入新鲜培养基的不断加入, ,保证了养分的充分保证了养分的充分供应供应；；（（2 2））可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中；；（（3 3））适于大规模工业化生产适于大规模工业化生产培养时间培养时间培培养养细细胞胞数数目目123451、连续培养的特点：(1)(1)半连续培养半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液充加入等量的新鲜培养液(2)(2)连续培养连续培养：： 不断注入新鲜培养基，排掉旧的培养基不断注入新鲜培养基，排掉旧的培养基2、连续培养的种类：半连续培养半连续培养 利用培养罐进行大量细胞培养的一种培养方式利用培养罐进行大量细胞培养的一种培养方式 当培养罐内细胞数目增殖达到一定数量后，将当培养罐内细胞数目增殖达到一定数量后，将1/21/2的细胞悬的细胞悬浮液倒于另一个培养罐中，分别添加新鲜培养基继续培养浮液倒于另一个培养罐中，分别添加新鲜培养基继续培养 该培养方法能重复地获得大量均匀一致的培养细胞。

该培养方法能重复地获得大量均匀一致的培养细胞 半连续培养加入培养基加入培养基排出培养基及其培养物排出培养基及其培养物连续培养图示：连续培养图示：利用特制的培养容器进行大规模利用特制的培养容器进行大规模利用特制的培养容器进行大规模利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式细胞培养的一种培养方式细胞培养的一种培养方式细胞培养的一种培养方式特点：特点：特点：特点：⑴⑴⑴⑴不断注入新鲜培养基，排掉旧不断注入新鲜培养基，排掉旧不断注入新鲜培养基，排掉旧不断注入新鲜培养基，排掉旧的培养基，可以保证养分的充足的培养基，可以保证养分的充足的培养基，可以保证养分的充足的培养基，可以保证养分的充足供应，不会出现悬浮培养物发生供应，不会出现悬浮培养物发生供应，不会出现悬浮培养物发生供应，不会出现悬浮培养物发生营养亏缺的现象营养亏缺的现象营养亏缺的现象营养亏缺的现象⑵⑵⑵⑵可在培养期间内使细胞长时间可在培养期间内使细胞长时间可在培养期间内使细胞长时间可在培养期间内使细胞长时间保持在对数生长保持在对数生长保持在对数生长保持在对数生长⑶⑶⑶⑶适于大规模工厂化生产适于大规模工厂化生产适于大规模工厂化生产。

适于大规模工厂化生产细胞的工厂化生产工厂化生产途径的工厂化生产途径的3 3个步骤：个步骤：1.1.高产细胞株的选择高产细胞株的选择 将所分离纯化的细胞群，以一定密度接种进行平板培将所分离纯化的细胞群，以一定密度接种进行平板培养养, ,根据不同培养目的对其进行鉴定和测定，从中选择出高根据不同培养目的对其进行鉴定和测定，从中选择出高产、高品质的单细胞无性系产、高品质的单细胞无性系2.2.““种子种子””培养培养 对高产的细胞株或细胞无性系进行扩大繁殖，目的是对高产的细胞株或细胞无性系进行扩大繁殖，目的是获得培养细胞来用做大量培养时的接种材料获得培养细胞来用做大量培养时的接种材料3.3.细胞的大规模培养细胞的大规模培养 将选择的目的单细胞无性系，用发酵罐或生物反应器将选择的目的单细胞无性系，用发酵罐或生物反应器进行工厂化细胞培养以生产所需要的化合物进行工厂化细胞培养以生产所需要的化合物 FMSFMS  (II)(II)  型台式发酵罐适用于如基因型台式发酵罐适用于如基因工程菌高密度高表达需要的高供氧、快速工程菌高密度高表达需要的高供氧、快速均匀升温等要求，能迅速实现生物技术实均匀升温等要求，能迅速实现生物技术实验室成果转化。

验室成果转化 其主要技术特点：其主要技术特点： 采用独特的外循环水泵控温系统简洁有效采用独特的外循环水泵控温系统简洁有效的单片计算机自动控制和数据采集系统以的单片计算机自动控制和数据采集系统以及最新器件及最新器件直观的带光电显示工艺流程示意图直观的带光电显示工艺流程示意图新颖美观的整体外型和赋有人性化的设计新颖美观的整体外型和赋有人性化的设计细胞培养主要应用细胞培养主要应用1 1、、 植物有用物质的生产植物有用物质的生产2 2、诱发和筛选突变体、诱发和筛选突变体3 3、原生质体培养和细胞分离、原生质体培养和细胞分离4 4、食品生产、食品生产问题探究（一）（一） 植物次生代谢产物的生产植物次生代谢产物的生产 细胞培养生产次生代谢产物的特点细胞培养生产次生代谢产物的特点: : 1 1、不受季节变化、土地制约、地域气候条件的影响；、不受季节变化、土地制约、地域气候条件的影响； 2 2、可以人为控制培养条件、提高次生代谢产物的产量；、可以人为控制培养条件、提高次生代谢产物的产量； 3 3、可排除病菌、虫害的影响；、可排除病菌、虫害的影响； 4 4、利于大规模工业化生产。

利于大规模工业化生产二）（二） 进行特定的生物转化反应进行特定的生物转化反应 生物转化：通过一系列生理生化反应，将天然有机物产物转化为生物转化：通过一系列生理生化反应，将天然有机物产物转化为新的化合物或提高该物质的产量的过程例如，高辛、茛菪碱等合新的化合物或提高该物质的产量的过程例如，高辛、茛菪碱等合成天然化合物的生产与转化例如在培养基中加入不同浓度的例如在培养基中加入不同浓度的NaClNaCl，通过胁迫诱变和筛选抗，通过胁迫诱变和筛选抗盐突变体还可以向培养基中加入病原体的毒蛋白，以诱变和盐突变体还可以向培养基中加入病原体的毒蛋白，以诱变和筛选筛选抗病突变体抗病突变体为了改善为了改善作物品质作物品质，可以进行抗赖氨酸类似物的诱变与筛选，，可以进行抗赖氨酸类似物的诱变与筛选，即在培养基中加入不同浓度的赖氨酸类似物，可以获得抗赖氨即在培养基中加入不同浓度的赖氨酸类似物，可以获得抗赖氨酸类似物突变体这种突变体中的赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和酸类似物突变体这种突变体中的赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的水平升高异亮氨酸的水平升高总之，借助植物的细胞培养，可以从多途径上用于作物的总之，借助植物的细胞培养，可以从多途径上用于作物的改良改良研究。

研究细胞突变体的诱变与筛选：思考题思考题1.1.什么是细胞培养？细胞培养的方式有哪些？各有什么是细胞培养？细胞培养的方式有哪些？各有什么优缺点？什么优缺点？2.2.细胞悬浮培养定义？成批培养的几个时期是什么细胞悬浮培养定义？成批培养的几个时期是什么？连续培养是选用的那个时期？？连续培养是选用的那个时期？3.3.细胞细胞悬浮悬浮培养有哪些用途？培养有哪些用途？。