疫组化显色系统ppt课件.ppt

免疫组化显色系统Visualization Systems ofImmunohistochemistry(IHC)免疫组化技术原理•用标志物或显色物标志抗体或抗原•经过免疫学中的抗原与知抗体反响来检测组织或细胞内的抗原成分•免疫组化染色是一项综合性技术•组织资料的预备•免疫组化染色前处置•免疫组化染色(一抗, 显色系统)免疫组化原理图标注解一抗 1一抗 2抗兔二抗抗鼠二抗组织抗原1抗原2过氧化物酶碱性磷酸酶双染阻断剂显色剂(棕色)显色剂(红色)葡聚糖骨架分子回想过去直接法直接法二步间接法二步间接法三步间接法三步间接法酶免疫复合物法酶免疫复合物法链亲和素链亲和素-生物生物素法素法(ABC)目前常用的显色系统•一步法: EPOS ( Enhanced Polymer One-Step Staining)•二步法: EnVision Systems•双染: General Doublestain •三步法: LSAB (Labeled Sstreptavidin-biotin)•催化放大系统:CSA (Catalyzed Signal Amplication System)•动物研讨试剂盒: ARK (Animal Research Kit)一步法EPOS•原理: • 在一抗上经过多聚骨架标志过氧化物酶.即一抗上已标志过氧化物酶. 这种一抗与抗原结合后即可直接显色.多聚骨架分子特异性一抗组织抗原过氧化物酶一步法EPOS•主要实验流程组织片脱蜡,水化阻断(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗/HRP(U…)TBS冲洗(S1968)显色剂 DAB或AEC(K3467或K0697)水漂洗素木精复染(S3309)一步法EPOS特点:一抗孵育后直接显色即用型试剂快速(一步)完成敏感性较差昂贵运用对象:要求快速出结果的免疫组化实验对象二步法EnVision•原理: • 在葡聚糖大分子上标志二抗及酶, 将传统的二抗和三抗(酶)衔接在一同,构成一个复合物EnVision. 两步孵育完成免疫组化.二步法EnVision•原理图一抗与抗原结合EnVision二抗复合物与一抗结合二步法EnVision•主要实验流程阻断内过氧化酶(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗孵育(Mo . Rb.)EnVision(Mo.K4001 Rb.K4003) TBS冲洗(S1968)显色剂DAB或AEC(K3467或K0697)苏木精复染(S3309)TBS冲洗(S1968) 二步法EnVision 特点: 二抗及酶经过葡聚糖连成一个大分子试剂(避开了传统的生物素与链亲和素结合), 不受内源性生物素干扰.即用,方便,快速(两步).敏感性强. 背景低.是目前最理想的免疫组化显色系统运用对象可向一切做免疫组化的用户引荐.EnVision二步法双染原理: 与EnVision二步法原理一样, 只是为到达在同一组织上标志两种抗原. 必需用两种动物来源的一抗(常用抗小鼠和兔),分别配相应的EnVision(二抗) , 再用两种颜色的显色剂显色.EnVision二步法双染•原理图鼠一抗接抗原1鼠EnV/HRP接抗鼠一抗DAB(显色剂1)双染阻断剂兔一抗接抗原2兔EnV/AP接抗兔一抗Fast Red(显色剂2)EnVision二步法双染•主要实验流程阻断内过氧化酶(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗(1 Mo.)孵育TBS冲洗(S1968)EnVision/HRP( 1 Mo.)TBS冲洗(S1968)显色剂 1 DAB(K3467)蒸馏水冲洗双染阻断剂(Kit含)一抗(2 Rb.)孵育TBS冲洗(S1968)EnVision/AP( 2 Rb.)TBS冲洗(S1968)显色剂 2Fast Read(K0597)蒸馏水冲洗苏木精复染(S3309)EnVision二步法双染特点:即用,方便,快速,省时.敏感性强. 背景低.在同一组织切片上, 用两种不同标志物标志两种不同的抗原.运用对象需在同一张切片上标志两种抗原者 主要是形状学科研人员三步法三步法 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin)原理: 运用生物素标志二抗与过氧化物酶或碱性磷酸酶标志链亲和素(Streptavidin)的亲和作用, 衔接一抗及抗原, 构成大分子.再经过相应酶的底物(显色剂)作用使之显色.三步法三步法 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin)原理图:一抗与抗原结合二抗/Bio与一抗结合STPA/HRP(AP)与二抗/Bio结合三步法三步法 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin)•主要实验流程 阻断内过氧(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗孵育(Mo . Rb.)TBS冲洗(S1968) TBS冲洗(S1968)二抗/生物素 (Mo.E354 Rb.E353) TBS冲洗(S1968)显色剂DAB或AEC(K3467或K0697)Fast Read(K0597或K0699)苏木精复染(S3309)链亲和素/HRP或AP蒸馏水冲洗三步法三步法 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin)特点:廉价有现成的兔, 鼠, 羊通用试剂盒会有内源性生物素呵斥的非特异性背景运用对象可向一切做免疫组化的用户引荐.催化放大系统催化放大系统CSA (Catalyzed Signal Amplication System)原理 在经典三步法免疫组化放大根底上,经过生物素化酪胺的催化,将又一次参与的酶标志链亲和素(Streptavidin-enzyme)与二抗中生物素亲和,使已放大的分子再一次放大.催化放大系统催化放大系统CSA (Catalyzed Signal Amplication System)•原理图一抗与抗原结合 二抗/Bio与一抗结合STAV/Bio与二抗/Bio结合放大液催化参与STAV/HRP与Bio再结合催化放大系统催化放大系统CSA (Catalyzed Signal Amplication System)主要实验流程: 阻断内过氧(S2001)水洗TBS冲洗(S1968)二抗孵育(Rb a-Mo/Bio)TBS冲洗(S1968) 放大液(Kit含)链亲和素/生物素 Strep./Bio (Kit含) TBS冲洗(S1968)显色剂DAB或AEC(Kit含)苏木精复染(S3309)链亲和素/过氧化物酶 Strep./HRP(Kit含)蒸馏水冲洗蛋白阻断剂(Kit含)一抗孵育(Mo)TBS冲洗(S1968)TBS冲洗(S1968)TBS冲洗(S1968)催化放大系统催化放大系统CSA (Catalyzed Signal Amplication System)特点:敏感性极强实验步骤较多较贵运用对象:需做免疫组化实验者, 特别适用于某些石蜡片不易出结果的一抗.动物研讨试剂盒动物研讨试剂盒 ARK (Animal Research Kit)•原理• 在一抗与组织抗原反响之前: 小鼠一抗F(c)与生物素化抗小鼠F(ab)片断结合,再参与小鼠免疫球蛋白, 中和未被结合的生物素化抗小鼠F(ab). 用该复合物再与小鼠组织中特异抗原反响, 可降低非特异性背景. 动物研讨试剂盒动物研讨试剂盒 ARK (Animal Research Kit)•原理图小鼠一抗抗小鼠IgF(ab)/Bio免疫复合物/Bio和游离抗小鼠Ig F(ab)/Bio免疫复合物/Bio和游离抗小鼠Ig F(ab)/Bio小鼠Ig免疫复合物/Bio和被中和的抗小鼠Ig F(ab)/Bio与组织抗原结合按LSAB法继续免疫组化染色动物研讨试剂盒动物研讨试剂盒 ARK (Animal Research Kit)•主要实验步骤 一抗与组织抗原反响之前需做试剂的预处置:小鼠一抗 + 抗小鼠Ig的F(ab)/Bio复合物 1复合物 1 + 小鼠Ig 复合物 2 (已优化的一抗)用复合物2作为一抗同LSAB三步法免疫组化染色动物研讨试剂盒动物研讨试剂盒 ARK (Animal Research Kit)•特点• 小鼠一抗在小鼠组织切片上做免疫组化可降低背景.•运用对象• 需用小鼠一抗做小鼠组织的免疫组化实验者.几种显色系统复杂与敏感性比较目前最适用的显色系统目前最适用的显色系统•EnVision System•EnVision+ /Mo (K4000 K4001 GK400105)•EnVision+/Rb (K4002 K4003 GK400305) •EnVision Mo/Rb HRP (k0 K2 GK305)•EnVision Mo/Rb AP (K6 k4016)。