酪氨酸酶催化活性论文.doc

酪氨酸酸酶的提取及催化活性的研究酪氨酸酸酶的提取及催化活性的研究一、实验目的一、实验目的认识生物体中酶的存在和催化作用，了解从土豆中提取酶的方法和研究酶 活性的一般方法，学会用现代分析手段研究催化反应，特别是生物化学体系中 催化过程的基本思路和方法二、实验原理二、实验原理许多复杂的有机物合成与分解反应需要在高温、高强酸碱或减压等苛刻条 件下才能进行，而在生物体内，即使在十分温和的条件下，如常温、常压和近 中性溶液中，许多复杂的化学反应却能顺利进行，其根本原因就是由于生物酶 的存在生物酶是一种生物催化剂，按照它的组成，可分为两类，一类是简单 蛋白质，其活性取决于它的结构，如脲酶、淀粉酶等；第二类的结合蛋白质酶， 它需要加入某些非蛋白质组分（称为辅助因子）后，才能表现出酶的活性酶 蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶例如酪氨酸酶是以铜离子为辅 助因子的全酶 通常反被酶作用的物质称为该酶的底物，一种酶催化特定的一个或一类底 物的反应，具有很高的选择性和灵敏度，因而引起广大分析工作者的重视和兴 趣酶已作为一种分析试剂得到应用特别是有生化、医学方面有很高的应用 价值例如生命物质和流体中的特殊有机成分，用其他方法测定有困难，用酶 法分析却有其独到之处。

本实验从土豆中提取酪氨酸酶，并测定其催化活性当土豆、苹果、香焦 等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的，这是这类物质含 有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在空气中后，在氧气的参与 下，会发生一系列反应以下是主要的反应过程由于多巴转变成多巴红 的反应速率较快，再转到下 一步产物速率则慢得多，故 可选择多巴转变为多巴红的 反应速率的测定来判断催化 反应的活性因多巴红具有 特殊的颜色，故可用分光光 度法测定，在不同的时刻测 定某特定波长下的吸光度， 用吸光度对时间作图，从所 得的直线斜率求酶的活性 酶的活性计算方法：一 般定义在优化的条件下（包 括 pH 值、离子强度、温度等） ，25℃时在 1min 内转化1mol 底物所需要催化剂的量为活性单位通过下式可计算酶的活性：，式中，为所用溶液的酶的活性，为最大吸610   ktVAaaA 收波长吸光度的变化，t为时间（min） ，k为多巴红的摩尔吸收系数，V 为加入酶的体积，进而计算出原料（土豆）中酶的活性：式中 A 为原料maVo/A  中酶的活性（注意此处 A 不是吸光度 A） ，V0为原料所得的酶溶液的总体积， m 为原料总质量。

三、所需主要试剂及仪器三、所需主要试剂及仪器1. 试剂及材料 酪胺酸：酪氨酸在中性水溶液中溶解度较小，因而配制过程中需加入一定量盐酸溶解首先取一定酪氨酸配制 0.1mol/L 酪氨酸储备液，在实验过程中稀 释至 20mmol/L，使用时需要加入一定量的 NaOH 调节其 pH 接近中性 磷酸盐配制的 pH=7.2 和 pH=6.0 及 pH=5.8 的缓冲溶液 称取 2.7202g KH2PO4，NaOH0.8003g 各自定容于 100 mL 容量瓶中，然后按 下面的方法得到所需的缓冲溶液 X mL0.2mol/L KH2PO4＋ y mL0.2mol/LNaOH 加水稀释至 20mLpHxy5.8251.860 6.0252.850 7.22517.50酪氨酸的滴定：2 mL 酪氨酸在指示剂酚酞下 1.60 mL0.2mol/LNaOH 滴定为中性 铜试剂：0.1017g 定容于 100ml 容量瓶中 土豆：新鲜土豆 2. 仪器 分光光度计、离心机、研钵、食物研磨机、恒温水浴、纱布、计时秒表、 冰箱等四、实验步骤四、实验步骤1. 酶的提取：取土豆，清洁后切碎，研磨后取 2.5 mL 液体，加入 7.5mL pH=7.2 的磷酸缓冲溶液，立即高心分离（3000rpm）5min，倾出上层清澈保存 于冰箱中，提取液为棕色，在放置过程中不断变黑。

2. 酪氨酸的吸收光谱绘制： 取 0.4mL 提取液于 10mL 比色管，加 2mL 的酪氨酸溶液，用 pH=6.0 的缓冲溶液稀释至刻 度，摇匀，反应 10min 后，在分光光度计上取波长 240nm-----300nm 范围进行扫描，找到 最大吸收波长；如图：波长/nm240250260270280290300吸光度0.0710..0730.0750.0760.0780.0710.056 故而可以知道最大波长是 280nm 3.酶的活性测量 取 0.4mL 提取液于 10mL 比色管，加 2mL 的酪氨酸溶液，用 pH=6.0 的缓冲溶液稀释至刻 度，摇匀，同时开始计时，分光光度计在最大吸收波长下测吸光度开始 6min 内，每分钟测一次，后隔 2min 读一次，至吸光度变化不大为止 ；时间/min0123456吸光度0.0720.0730.0730.0740.0730.0740.0744. 酶活性的影响因素 ① 温度，取 0.4mL 提取液于 10mL 比色管，加 2mL 的酪氨酸溶液，用 pH=6.0 的缓冲溶 液稀释至刻度，摇匀，在 40℃，50℃，60℃温度下水浴反应 10min 后，分别测其吸光 度，记录如下温度/℃405060吸光度0.0390.0290.025由此可见，不同温度下酶的活性也不同，故而在最适温度下酶的活性最大。

②pH,取 0.4mL 提取液于 10mL 比色管，加 2mL 的酪氨酸溶液，分别用 pH=5.8,pH=6.0，pH=7.2 缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，反应 10min 后分别测其吸光度；记 录如下pH5.86.07.2吸光度0.0240.0310.029由此可见，在不同 pH 下酶的活性也不相同，而偏酸或偏碱性都会造成酶活性降低 ③酶浓度，分别取 0.2, 0.3, 0.4, 0.5mL 提取液于 10mL 比色管，加 2mL 的酪氨酸溶液， 用 pH=6.0 的缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，反应 10min 后分别测其吸光度；记录如下：酶浓度0.20.30.40.5吸光度0.0240.0240.0310.042由此可见，酶浓度高出一定范围会影响酶活性 ④底物浓度，取 0.4mL 提取液于 10mL 比色管，分别往比色管中加 1.0mL、1.5mL、 2mL、2.5mL、3.0mL 的酪氨酸溶液，用 pH=6.0 的缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，反应 10min 后测其吸光度，记录如下：酪氨酸体积/mL1.01.52.02.53.0吸光度0.0130.0180.0240.0290.033由此可见，底物浓度对酶活性无太大影响。

⑤抑制剂，取往四个比色管中分别加入 0.0 mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL EDTA 溶液，再分别 0.4mL 提取液于各 10mL 的比色管，加 2mL 的酪氨酸溶液，用 pH=6.0 的缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，反应 10min 后测其吸光度，记录如下：EDTA 溶液体积/mL0.01.02.03.0吸光度0.0310.0270.0230.018由此可见，抑制剂过多会降低酶活性六、思考题六、思考题1.影响酶的活性因素有哪些？ 答：影响酶的活性因素有：酶浓度、温度、抑制剂、pH 值2.提取物放置过程中为什么变黑？答：酶与底物发生了反应，产生黑色素，致使提取物变黑3.加热后酶的活性为什么明显降低？ 答：因为酶只有在一定温度下才具有较高的活性，温度太高会使蛋白质变 性，温度太低活性较低结果分析： 实验中每次读数都会存在一定的时间偏差，会对读数产生一定的影响 测定抑制剂对酶活性的影响时，因铜试剂对酶的抑制太明显，只得出铜试剂 对酶活性有较大影响，而没得出可以完全抑制酶活性的铜试剂的最小量 测定温度对酶活性的影响时，由于保温效果不是很好，存在一定误差 在该实验中，我主要负责不同 pH 溶液的配制以及与买永明一同测定抑制剂 和 pH 对酶活性的影响。

该实验中由于酪氨酸溶液显酸性，酶只有在此 pH 中可 能会变性而失去活性，而在配制溶液中，加入提取液之前与加入后的 pH 不同 因此，尽量最后加入提取液。