PCR中防治出现假阴性.docx

PCR中防治出现假阴性、假阳性.假阴性，不出现扩增条带酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决如一条引物亮度高一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

或lOOul,应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如2Oul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的二.假阳性，出现非特异性扩增带1•假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性需重新设计引物靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒所用离心管及样进枪头等均应一次性使用③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增其对策有：①必要时重新设计引物②减低酶量或调换另一来源的酶③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数④适当提高退火温度或采用二温度点法（93°C变性，65°C左右退火与延伸）2. 出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶②减少dNTP的浓度③适当降低Mg2+浓度④增加模板量，减少循环次数。