植物组织培养技术原理之灭菌方法.docx

植物组织培养技术原理之灭菌方法 植物组织培养技术原理之灭菌方法 灭菌是组织培养重要的工作之一初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的依此观点，无菌室等未经处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物茵的特点是：极小，肉眼看不见无处不在，无时不有，无孔不人在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的)，高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小得多灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然 经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台、等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。

在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作1、常用的灭菌方法：常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌（培养基）培养基在制备后的24h内完成灭菌工序高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加在o．1MPa的压力下，锅内温度达121℃在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到O．05MPa 时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀关阀再通电后，压力表上升达到0．1MPa时压力 0．1-0．15MPa，20min对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。

而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌 20-30min高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2-0.3单位高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决于多种因素在高压灭菌前用碱调高pH值至预定值的则相反培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的pH值变化幅度较大，甚至可大于2个pH值单位环境pH值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压在8%-20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0．43倍培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖培养基值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%2、防止高压灭菌培养基变化的方法：(1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，及时采取有效措施2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。

如避免使 用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序如将磷、钙和铁放在最后加入4)注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态如高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48而96h后又回降至5.8左右这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握3、灼烧灭菌（用于无菌操作的器械）在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌冷却后，立即使用操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具4、干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）干热灭菌是利用烘箱加热到 160-180~C的温度来杀死微生物由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽抱的抗热水平，通常采用170℃持续90min来灭菌干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染包扎可用耐高温的塑料灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。

干热灭菌能源消耗太大，浪费时间5、过滤灭菌（不耐热的物质）一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐 热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法 防细菌滤膜的网孔的直径为0.45μm以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液6、紫外线和熏蒸灭菌（空间）(1)紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜2)熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5—8ml／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。

熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表 面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外7、喷雾灭菌（物体表面）物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%—1%的新洁尔灭也可以8、植物材料表面用消毒剂灭菌从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物这些污染源一旦带人培养基，便会造成培养基污染因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。

流水冲洗在污染严重时特别有用洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触当然，最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温第二步是对材料的表面浸润灭菌要在超净台或接种箱内完 成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等用70%酒精浸10～30s由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料第三步是用灭菌剂处理表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1—2种使用见表上述灭菌剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内贮用次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水涮洗3—4次即可；由于用升汞 液灭菌的材料，难以对升汞残毒较难去除，所以应当用无菌水涮洗8～10次，每次不少于3min，以尽量去除残毒。

灭菌时，把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒人消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底在快到时间之前1—2min，开始把消毒液倾人一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅涮洗灭菌时间是从倒人消毒液开始，至倒入无菌水时为止记录 时间还便于比较消毒效果，以便改正灭菌液要充分浸没材料，宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌在灭菌溶液中加吐温—80或Tnton X效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸人到灭菌的材料表面但吐温加人后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的O.5%，即在100ml加入15滴最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。