分子医学技能-实验6.ppt

实验六实验六n离子交换层析离子交换层析n紫外吸收法定量测定蛋白质紫外吸收法定量测定蛋白质离子交换层析离子交换层析n层析技术（层析技术（chromatography）） 层析技术一般原理层析技术一般原理 层析技术分类及应用层析技术分类及应用溶有叶绿素的乙醚溶有叶绿素的乙醚碳酸钙粉末碳酸钙粉末黄色的色带（叶黄素）黄色的色带（叶黄素）绿色的色带（绿色的色带（ββ-胡萝卜素）胡萝卜素）继续洗脱，分段收集，就可以使叶黄继续洗脱，分段收集，就可以使叶黄素和素和ββ-胡萝卜素分离胡萝卜素分离叶绿素的层析叶绿素的层析层析法层析法: :（色谱法）（色谱法） 利用待分离的样品中各组分的理化性质利用待分离的样品中各组分的理化性质（吸附力、分配系数、电荷、分子量、（吸附力、分配系数、电荷、分子量、亲和力等）的差异，使其在亲和力等）的差异，使其在流动相流动相的作的作用下通过用下通过固定相固定相时的移动速度不同，从时的移动速度不同，从而达到相互分离的目的而达到相互分离的目的 n固定相：固定不移动的一相，一般是指固定相：固定不移动的一相，一般是指支持物中所含的水分阻止所分离的样支持物中所含的水分。

阻止所分离的样品向前移动（阻力）品向前移动（阻力）n流动相：流动相： 洗脱时所用的溶剂，也叫洗脱洗脱时所用的溶剂，也叫洗脱液不断地前移，并带动所分离的样品液不断地前移，并带动所分离的样品向前移动（动力）向前移动（动力）n洗洗 脱：脱： 用洗脱液冲洗层析柱，使样品用洗脱液冲洗层析柱，使样品中不同组分得以分离的过程中不同组分得以分离的过程n洗脱曲线：以洗脱的体积为横坐标，组洗脱曲线：以洗脱的体积为横坐标，组分的浓度为纵坐标作图所得的曲线分的浓度为纵坐标作图所得的曲线层析法分类（按装置分类层析法分类（按装置分类 ）） 纸层析纸层析 薄膜层析薄膜层析柱层析柱层析洗脱液洗脱液样品样品填充物填充物分部收集分部收集玻璃柱玻璃柱层析法层析法分类及原理分类及原理按分离按分离原理原理分类分类n吸附层析吸附层析n分配层析分配层析n凝胶过滤凝胶过滤（分子筛层析）（分子筛层析）n离子交换层析离子交换层析n亲和层析亲和层析各类层析的原理和载体各类层析的原理和载体 类别类别 分离原理分离原理 基质或载体基质或载体吸附层析吸附层析 化学、物理吸附化学、物理吸附 硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝 、羟基磷、羟基磷酸酸分配层析分配层析 两溶剂相中的溶解效应两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土纤维素、硅藻土 、硅胶、硅胶凝胶层析凝胶层析 分子筛效应的排阻效应分子筛效应的排阻效应 sepharose 、、sephadex离子交换层析离子交换层析 离子基团的交换反应离子基团的交换反应 离子交换树脂离子交换树脂 、纤维素、、纤维素、 葡聚糖葡聚糖亲和层析亲和层析 分离物与配体之间有分离物与配体之间有 带配基的带配基的sepharose 特殊亲和力特殊亲和力 或或sephadex离子交换层析离子交换层析（（ion-change chromatography））原理：原理：用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）用离子交换剂（具有离子交换性能的物质） 作固定相，利用它与流动相中的离子进可逆作固定相，利用它与流动相中的离子进可逆 交换性质来分离离子型化合物的层析方法。

交换性质来分离离子型化合物的层析方法 即溶液中的离子同离子交换剂上即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交功能基团交 换反应换反应的过程 应用：应用： 制备纯化生物物质、制备纯化生物物质、 定量、定性测定混合物中各组分定量、定性测定混合物中各组分1.平衡阶段平衡阶段:离子交换剂与反离子交换剂与反离子结合离子结合2. .吸附阶段：样品与反离子吸附阶段：样品与反离子进行交换进行交换3、、4. 解吸附阶段：用梯度缓解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质物质，后洗下强吸附物质5、再生阶段：用原始平衡液、再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，可重复使用进行充分洗涤，可重复使用12345原始缓冲溶原始缓冲溶液的反离子液的反离子样品溶液样品溶液梯度浓度梯度浓度 带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来， 带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来离子交换剂的种类离子交换剂的种类离子交换剂：离子交换剂：在惰性载体上引入带有电荷在惰性载体上引入带有电荷的活性基团的物质。

的活性基团的物质根据活性功能基团带电荷性质分为：根据活性功能基团带电荷性质分为：阳离子交换剂阳离子交换剂 — 带负电荷，与阳离子交换带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂阴离子交换剂 — 带正电荷，与阴离子交换带正电荷，与阴离子交换按载体种类不同按载体种类不同离子交换树脂：离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂主要有聚苯乙烯树脂苯乙烯苯乙烯+二乙烯苯二乙烯苯  聚苯乙烯聚苯乙烯 （单体）（交联剂）（单体）（交联剂） 二乙烯苯二乙烯苯交联度交联度 = ———————— × 100% 苯乙烯苯乙烯 + 二乙烯苯二乙烯苯 n交交联联度度大大，，网网孔孔变变小小，，大大分分子子量量的的离离子子不能进入树脂颗粒内发生离子交换不能进入树脂颗粒内发生离子交换n在不影响分离的情况下，以采用交联度在不影响分离的情况下，以采用交联度较高的树脂为好，这样可以提高树脂对较高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性离子的选择性 。

目数：离子交换树脂的颗粒直径大小目数：离子交换树脂的颗粒直径大小 Dowex 50 为为20-50目目Dowex 20 840 m 50 297 m 100 149 m （代表二乙烯苯的百分含量）（代表二乙烯苯的百分含量）阳离子交换树脂阳离子交换树脂 强酸型强酸型 含磺酸基团含磺酸基团 (R-SO3H) 中等酸型中等酸型 含磷酸基团含磷酸基团 (-O-PO2H4) 弱酸型弱酸型 含酚基、羧基含酚基、羧基阴离子交换树脂阴离子交换树脂 强碱强碱 含季胺基团含季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱弱碱 含叔胺、伯胺基团含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2 阴阴离离子子交交换换树树脂脂对对化化学学试试剂剂及及热热都都不不如如阳阳离离子子交换树脂稳定交换树脂稳定离子交换离子交换纤维素纤维素n阴阴离离子子交交换换纤纤维维素素 —如如:DEAE-纤纤维维素素 pH8.6以以下下分分离离中中性性或或酸酸性性物物质质,聚聚二二乙乙胺胺乙基乙基n阳离子交换纤维素阳离子交换纤维素—如如:CM-纤维素纤维素 一一般般pH>4条件下使用条件下使用,具有羧甲基具有羧甲基 离子交换凝胶离子交换凝胶— 分离大分子物质分离大分子物质如如：：葡葡聚聚糖糖（（Sephadex））、、 聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺（（PAG）、琼脂糖（）、琼脂糖（Sepharose））实验要点实验要点离子交换剂的选择离子交换剂的选择原原则则：：根根据据被被分分离离物物质质的的性性质质选选择择—同同一一性性质质离离子子交交换换剂剂中中选选用用对对被被分分离离物物质质各各组组分分之之间间结结合合力力差差异异大大的的型型号号交交换换剂剂，，以以保保证证通通过过离离子子交交换换层层析析后后能得到比较满意的结果。

能得到比较满意的结果n被分离物质带何种电荷被分离物质带何种电荷n被被分分离离物物质质分分子子的的大大小小，，大大分分子子物物质质选选用用凝凝胶胶，，其次选用纤维素其次选用纤维素n被分离物质所处的环境被分离物质所处的环境n被分离物质的物理化学性质被分离物质的物理化学性质n被分离物质的大概数量被分离物质的大概数量缓冲液的选择缓冲液的选择原原则则：：不不能能发发生生化化学学反反应应，，所所带带电电荷荷应应与与样样品品一一致避免使样品变性致避免使样品变性洗脱剂的选择洗脱剂的选择 原原则则：：所所用用洗洗脱脱液液比比吸吸着着物物质质具具有有更更活活泼泼的的离离子或基团子或基团 改变改变pH或离子强度或离子强度 ：： 增强洗脱液与离子交换剂的结合力增强洗脱液与离子交换剂的结合力 降低分离物与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱洗脱方式：梯度洗脱关于离子交换剂预处理关于离子交换剂预处理 离子交换纤维素要保证有较好的均匀度，溶胀离子交换纤维素要保证有较好的均匀度，溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带为带H+或或OH-的交换剂型。

阴离子交换剂常用的交换剂型阴离子交换剂常用“碱碱-酸酸-碱碱”处理，使最终转为处理，使最终转为-OH-型或盐型型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸酸-碱碱-酸酸”处理，使最终转为处理，使最终转为-H-型交换剂型交换剂  蛋白质的等电点一般低于蛋白质的等电点一般低于8，在，在pH为为8的弱离子的弱离子强度溶液带负电荷，可以被阴离子交换纤维素强度溶液带负电荷，可以被阴离子交换纤维素（（DEAE-纤维素）吸附当增加缓冲液离子强纤维素）吸附当增加缓冲液离子强度或阴离子电负性时，可以将蛋白质成批量洗度或阴离子电负性时，可以将蛋白质成批量洗脱下来，达到蛋白质浓缩的目的脱下来，达到蛋白质浓缩的目的离子交换层析的应用离子交换层析的应用n离子交换层析技术已广泛于各学科领域离子交换层析技术已广泛于各学科领域在生物化学及临床生化检验中主要用于在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子离子交换层析浓缩蛋白质溶液离子交换层析浓缩蛋白质溶液l本次实验使用本次实验使用DEAE－纤维素－纤维素DE-52，是，是弱碱性阴离子交换树脂。

弱碱性阴离子交换树脂l离子交换层析浓缩蛋白质溶液离子交换层析浓缩蛋白质溶液(每组一柱每组一柱) DE-52预处理：将预处理：将DE-52在蒸馏水中浸泡过夜，充分溶涨，然在蒸馏水中浸泡过夜，充分溶涨，然后倾去上清，加入过量的后倾去上清，加入过量的0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液浸泡磷酸盐缓冲液浸泡1小时，真空抽气小时，真空抽气试剂配制：试剂配制： Na2HPO4.12H2O 71.64 g 定量至定量至1 L （（0.2mol/L Na2HPO4）） NaH2PO4.2H2O 31.21 g 定量至定量至1 L （（0.2mol/L NaH2PO4）） 91.5ml Na2HPO4 ＋＋8.5ml NaH2PO4 加水定量至加水定量至1L，配成，配成0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 1.15g NaCl ＋＋ 1000ml 0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液，配成磷酸盐缓冲液，配成0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液－磷酸盐缓冲液－0.02mol/L NaCl；； 58.5g NaCl ＋＋ 1000ml 0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液，配成磷酸盐缓冲液，配成0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液－磷酸盐缓冲液－1mol/L NaCl 蛋白质溶液：蛋白质溶液：1g 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 ＋＋ 0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓磷酸盐缓冲液冲液 100ml，配成，配成10mg/ml 蛋白质溶液。

蛋白质溶液 步骤步骤l装柱：关上出口阀门，在层析柱内装入装柱：关上出口阀门，在层析柱内装入1/3体积的体积的0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液－磷酸盐缓冲液－0.02mol/L NaCl缓冲液，缓冲液，然后用一根玻璃棒将树脂导入层析柱，不要带入气泡然然后用一根玻璃棒将树脂导入层析柱，不要带入气泡然后打开出口阀门，保持后打开出口阀门，保持1ml/min的流速，使树脂堆积的流速，使树脂堆积l平衡：平衡：1倍柱体积的倍柱体积的0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液－磷酸盐缓冲液－0.02mol/L NaCl缓冲液流过，出口流速可保持在缓冲液流过，出口流速可保持在1ml/minl加样：取待浓缩蛋白质溶液加样：取待浓缩蛋白质溶液2ml在在752分光光度计检测溶液分光光度计检测溶液的的OD280读数等步骤读数等步骤2的平衡结束后，待平衡液下降接的平衡结束后，待平衡液下降接近柱面时，将出口阀门关闭，然后将近柱面时，将出口阀门关闭，然后将30ml的蛋白质溶液小的蛋白质溶液小心加入柱内，打开阀门，保持心加入柱内，打开阀门，保持1ml/min的流速，使蛋白质的流速，使蛋白质溶液缓慢进入柱内溶液缓慢进入柱内。

步骤步骤l平衡：两倍柱体积的平衡：两倍柱体积的0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液－－0.02mol/L NaCl 流过l洗脱：待平衡液下降接近柱面时，关上出口阀门，洗脱：待平衡液下降接近柱面时，关上出口阀门，加入加入0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液－磷酸盐缓冲液－1mol/L NaCl洗脱蛋白，打开阀门，以洗脱蛋白，打开阀门，以1ml/min的流速洗脱，并的流速洗脱，并开始用试管接流出溶液，每管接开始用试管接流出溶液，每管接5ml用752分光光分光光度计检测每管溶液的度计检测每管溶液的OD280读数，待读数，待OD280读数从读数从峰值降为峰值降为0.02时，停止洗脱，选取时，停止洗脱，选取OD280读数最高读数最高的洗脱液为浓缩蛋白的洗脱液为浓缩蛋白紫外吸收法定量测定蛋白质紫外吸收法定量测定蛋白质实验操作及注意事项实验操作及注意事项分光光度法的概念和相关知识分光光度法的概念和相关知识n分光光度法及其分类分光光度法及其分类n透光度（透光度（T）、吸光度（）、吸光度（A）、光密度）、光密度（（OD，，D））nLambert-Beer定律定律 D = KCL入射光入射光入射光入射光透射光透射光透射光透射光反射光反射光反射光反射光被被被被物物物物质质质质吸吸吸吸收收收收的的的的光光光光紫外吸收法定量分析蛋白质的原理紫外吸收法定量分析蛋白质的原理n原理：原理：Tyr、、Trp中含共轭双键（苯环）中含共轭双键（苯环） 280nm处有最大光吸收处有最大光吸收 测定范围：测定范围：0.1～～1.0mg蛋白蛋白/mLn优点：简单、快速、灵敏、样品可以回收优点：简单、快速、灵敏、样品可以回收n缺点：有一定的误差（原因）；缺点：有一定的误差（原因）； 受核酸类物质干扰受核酸类物质干扰蛋白质紫外吸收分析的实验操作蛋白质紫外吸收分析的实验操作n实验操作（示教），光度计构造与使用实验操作（示教），光度计构造与使用n结果分析：结果分析： 纯度分析：一般纯蛋白质的纯度分析：一般纯蛋白质的A280/A260约为约为1.8 浓度分析：浓度分析：OD280/ OD260<1.5时时 蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/ml）） =1.5A280-0.75A260 OD280/ OD260>1.5时时 蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/ml）） =A280/(K×L)牛血清蛋白牛血清蛋白 K=0.63mg/(ml.*cm) L=1cm。