色谱分析课程报告.doc

目录1理论概述 11.1液相色谱法定义： 11.2历史起源： 11.3基本原理： 11.4装置的基本组成及作用: 21.4.1进样装置 21.4.2色谱柱 21.4.3检测器 21.5发展状况： 32文献总结 33参考文献 6液相色谱分析技术应用1.1液相色谱法定义：色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的 检测手段，就成为色谱分析法1.2历史起源：1903年俄国植物化学家茨维特(7sweft)首次提出“色谱法〃 (Chromotography)和"色谱 图"(Chromatogram)的概念＜=他在论文中写到：“(原文)一植物色素的石油瞇溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管 滤下，后用纯石油瞇淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就 象光谱一样，称之为色谱图〃1930年以后，相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技术1952年，英国学者Martin和Synge基于他们在分配色谱方而的研究工作，提出了关于气一 液分配色谱的比较完整的理论和方法，把色谱技术向前推进了一大步，这是气相色谱在此后 的十多年间发展十分迅速的原因。

1958年，基于Moore和Stein的工作，离子交换色谱的仪器化导致了氨基酸分析仪的 出现，这是近代液相色谱的一个重要尝试，但分离效率尚不理想1960年中后期，气相色谱理论和实践发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步， 液相色谱又开始活跃到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了 HPLC =1970年中期以后，微处理机技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化水平和分 析精度1990年以后，生物工程和生命科学在国际和国内的迅速发展，为髙效液相色谱技术提 出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，如人类基因组计划，蛋白质组学有HPLC作预 分离等1.3基本原理：在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固 定相，我们把它叫做流动相色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能 力的不同来进行分离的使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互 不相溶的固定相表面当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相 发生相互作用由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱 不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相 保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。

与适当的柱后检测方法结合，实现 混合物中各组分的分离与检测14装置的基本组成及作用：1. 4.1进样装置注射器进样装置：进样所用微量注射器及进样方式与GC法一样进样压力150xl0A5Pa 时，必须采用停流进样⑵高圧定量进样阀：与GC法用的流通法相似，能在高压下进样1.4.2色谱柱色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）c通常用厚壁玻璃管或内壁抛光的不锈钢管制作 的，对于一些有腐蚀性的样品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管柱子内径 —般为1〜6 mm3常用的标准柱型是内径为4.6或3.9mm，长度为15〜30cm的直形不 锈钢柱填料颗粒度5 — 10pm ,柱效以理论塔板数计大约7000〜10000发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效1.4.3检测器⑴紫外光度检测器它的作用原理是基于被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光 度的关系遵守比尔定律最常用的检测器，应用最广，对大部分有机化合物有响应特点：a. 灵敏度高：其最小检测量故即使对紫外光吸收很弱的物质，也可以检测;b. 线性范围宽；（比尔定律）c. 流通池可做的很小（1mm x 10mm ,容积8|1L）；d. 对流动相的流速和温度变化不敏感可用于梯度洗脱；e. 波长可选，易于操作：女U,使用装有流通池的可见紫外分光光度计（可变波长检测 器）。

缺点：对紫外光完全不吸收的试样不能检测；同时溶剂的选择受到限制⑵光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；阵列由1024个光电二极管阵列，每个光迫二极管宽仅50Rm, 各检测一窄段波长如图所示，在检测器中，光源发出的紫外或可见光通过液相色谱流通池， 在此流动相中的各个组分进行特征吸收，然后通过狭缝，进入单色其进行分光，最后由光电 二极管阵列检测，得到各个组分的吸收信号经计算机快速处理，得三维立体谱图⑶荧光检测器荧光检测器是一种高灵敏度、高选择性检测器对多环芳坯，维生素B、黄曲霉素、吓咻类化合物、农药、药物、氨基酸、笛类化合物等有 响应荧光检测器的结构及工作原理和荧光光度计相似⑷差示折光检测器除紫外检测器之外应用最多的检测器差示折光检测器是借连续测定流通池中溶液折射率的方法来测定试样浓度的检测器溶 液的折射率是纯溶剂（流动相）和纯溶质（试样）折射率乘以各物质的浓度之和因此溶有 试样的流动相和纯流动相之间折射率之差表示试样在流动相中的浓度⑸电导检测器其作用原理是根据物质在某些介质中电离后所产生电导变化來测定电离物质含量1.5发展状况：液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为 经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有儿个小时）。

高效液相色谱法（High performance Liquid Chromatography, HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后 期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力, 需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（High Pressure Liquid Chromatography, HPLC）又因分析速度快而称为髙速液相色谱法（High Speed Liquid Chromatography, HSLP） o 也称现代液相色谱2文献总结仪器型号实验条件样品类型预处理步骤美国Waters公司 1525型高效液相色 谱仪，并配备有2487 紫外检测器，Breeze 英文色谱信息管理系 统Symmetry-Cl 8 色谱 柱（150 mm X 4. 6 mm, 5 Mm）（购自 Waters公司）,流 动相为V（0. 1%三氟 乙酸水溶液）/V （甲间硝基苯胺和邻硝 基苯胺配制浓度均为LOmg间硝基苯胺和 1. Omg・inl/邻硝基苯胺标准贮备液并置于冰 箱冷藏室保存间硝慕苯胺、邻硝慕苯胺均 为分析纯，二氯甲烷、乙醇、盐酸、氢氧化 钠均为分析纯，甲醇、乙睛为色谱纯，水为 经0.45 Mm过滤膜过滤的二次蒸馆水。

醇)=90/10；流速： 0. 3 mL min ；柱温: 30°C；检测波长：240 nm；进样体积：20 色谱岀峰时间 为：5. 685 min美国Waters公司 1525型高效液相色 谱仪,配备冇2998 型紫外检测器， Empower Project 色 谱信息管理系统；Symmctry-Cl8 型色 谱柱(150 mm X 4. 6 mm, 5 Pm)(购 自Waters公司)； 流动相为V (甲醇) /V (水)=70/30； 流速：0. 8 mL min '； 柱温：30 °C；检测 波长：225 nm；进样 体积：20 AL；三卩坐 酮色谱出峰时间： 3. 946 min三昨酮配制浓度为l.Omg-mL1三U坐酮标准贮备液 并置于冰箱冷藏室保存三醴酮、二氯甲烷、 乙醇、盐酸、氢氧化钠均为分析纯，甲醇、 乙惰为色谱纯，水为经0.儿5帥过滤膜过 滤的二次蒸镭水；平均外径为20-30 nm, 平均长度为30 Mm,比表面积>110 m2 • g 纯度>95毗％的普通多壁碳纳米管和竣基化 多壁碳纳米管均购自中国科学院成都冇机 化学研究所LC-quan 工 作站;Agilent C18 色谱 tt(2.1X150 mm ,3.5 u m);Kinetex2.6u C18 colum n (2.1 X 100 mm i.d., 2.6 和Ultimate XB- C18 colu mn (2.1 X 100 mm i.d.,3 0 m电源电压：(220± 10) V,室温:(20 ±5) °C,相对湿度： <80%口香糖，焙烤食品焙烤食品样品，在研钵中轻轻研磨至粉末 状，准确称取LOg研磨后的样品，加入50 ml水超声提取30 min,然后再8000 r/min 转速下离心5 mino取上清液用水稀释20 倍后再用0.22 uni尼龙膜过滤。

口香糖样品，在研钵中轻轻研磨至片状，准 确称取l.Og研磨后的样品，加入50ml水 超声提取30 min,将提取液转移至三角瓶 中，再向残渣中加入50 ml水超声提取30 min,合并两次提取液取提取液用水稀 释10倍后再用0.22 mn尼龙膜过滤Waters 600E 高效液 相色谱系统600四 元梯度泵，996PDA 二极管阵列检测器， 717P1US自动进样器 (美国)，Waters Millennium32色谱工作 站；色谱柱:Diamonsi 1 Ci8 柱(250nun X 4.6mm, 5!m);柱温: 30 °C流速： 1. OmL/min;进样体 积：20 uL;二极管 阵列检测器，检测 波长：215nm;流动 相：pH为2. 50的 3%CIIQI一 0. 05mol/L Na,HPO< (V/V)缓冲溶 液发酵饮料取一定体积酸奶样品，用50%的乙醇溶液 稀释至50mL容量瓶中，摇匀后，用台式 高速离心机12000r/min离心分离15min, 除去蛋白质沉淀，取上清液经0.45 pm针 头过滤器过滤后待检测PI2000高效液相 色谱-质谱联用 仪美国AppliedRestek Cis色谱柱(150mm X 2. 1mm, 5U m),流动相为含铜绿微囊藻藻将铜绿微囊藻藻液组织匀浆后，取5mL藻 液放入小烧杯中，加入10mL 100%甲醇溶 液，置于超声波细胞破碎仪中提取30min,biosystems 公 n］； Supeclo固相萃取装 美 国 Supelco 司;OASISHLB( 30mg) 固相萃取柱(SPE)美 国Waters公司。

有0.08%甲酸的甲 醇:水(80 : 20)柱 温25° C,检测器波 长238nm,进样量10 U L, 流速 0・ lmL/mino4500r/min离心lOmin,取上清液，残渣 再重复提取两次，合并上清液将上清液在 60°C水浴条件下浓缩至0.5〜lmL,加入 lOmL水,然后将其注入用10mL甲醇UOmL 水预先活化固相萃取柱中，萃取流速 3mL/mino样品全部吸附后，用10%的甲醇溶 液淋洗小柱以净化样品待用空气将固相萃 取小柱吹干后，用5mL的甲醇溶液减压洗 脱，将其定容到lmL,待测N- 2000双通道色谱 工作站浙江大学智 能信息工程研究所； SZ- 93自动双重纯 水蒸憾器上海亚荣 生化仪器厂；岛津 LC- 10AT高效液相 色谱仪，7725i型手 动进样阀,SPD- 10A 紫外检测器，岛津 UV- 265紫外可见分 光光度计功率：1200W 雾化气器流量 L/min： 0. 8色谱柱：Diamonsil 08 柱(250X4.6 mm, 5um);流动相：乙水(体积比为 70 : 30);检测波 长：230nm;流速： 1. OmL/min;柱温: 室温；。