协同凝集实验诊断副溶血性弧菌感染初步探析.doc

协同凝集实验诊断副溶血性弧菌感染初步探析【摘要】目的建立了一种快速简便的副溶血性弧菌的 检测方法方法将抗副溶血性弧菌多克隆抗体包被到金黄 色葡萄球菌Cowan I株上制成SPA菌体试剂，建立协同凝集 试验(COA),检测样品中可能的副溶血性弧菌结果COA检测 的敏感性为2X106 cfu/mL,检测过程为5 min112份临床 标本的测定结果与培养法相比较,COA的特异性、敏感性、诊 断符合率分别是100%、94.2%、97. 3%o结论本研究为发展 简便、敏感和快速的副溶血性弧菌的协同凝集检测试剂鉴定 基础关键词】副溶血性弧菌;协同凝集试验;检测方法[Abstract】 Objective To develop a simple and rapid method for detecting Vibrio parahaemo1yticus. Methods Staphylococcus aureus Cowan I was coated with anti Vibrio parahaemo1yticus polyclonal antibodies and a coagglutination test (COA)detecting Vibrioparahaemo1yt i cus in 112 samples was established・ Results The detect limit of COA was 2X 106 cfu/mL, and the detect time was 5 min. When 112 samples were tested, the diagnostic specificity, sensitivity and accuracy of the test, compared with standard culturemethods,were 100% 、 94.2% 、97. 3%,respectively.Conclusion This study lays a foundation for establishing simple and lesstime-consuming Vibrio pa.rahaemol yti cusCoagglutination Test kit・【 Key words 】 Vibrioparahaemo1yt i cus；Coagglutination test；Detectionmethod副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VP)是海洋和 盐湖中分布广泛的一种嗜盐性病原菌。

广泛分布在近海岸的 海水、海底沉积物、鱼类、贝类中，适应于高浓度(6%)食盐 的环境中生长，在不含食盐的培养基中不能生长该菌是亚 于霍乱弧菌的一种常见肠道致病菌，其污染会给海水养殖业 带来严重损失，还会引起人类腹泻等肠道疾病及食物中毒, 出现腹泻呈水样或血样便、腹部痉挛、恶心、呕吐和头痛等 症状[1-6] o自2001年以来，副溶血性弧菌性食物中毒爆发 已经成为中国最常见的食源性疾患，副溶血性弧菌性食物中 毒的起数和人数一直处于第一位多数金黄色葡萄球菌的细胞壁内含有一种特殊的蛋白 质，称为葡萄球菌A蛋白质(staphylococcal protein A, SPA), SPA的分子量为42 000,等电点为5. 1, —个分子内有4个相似的活性部位，能与人及多种哺乳动物(猪、兔、豚鼠 等)血清中IgG类抗体的Fc段非特异性结合IgG的Fc段与anSPA结合后，两个Fab段暴露在葡萄球菌菌体表面，仍保持其结合抗原的活性和特异性，当其与特异性抗原相遇时，能出 现特异的凝集现象在此凝集中，金黄色葡萄球菌菌体形成 了反应的载体，故称协同凝集试验(coagglutination test) 协同凝集试验可用于微生物的快速诊断、定种及定型，以协 助传染病的早期诊断。

本实验应用协同凝集试验建立了副溶血性弧菌的检测方法，为制备副溶血性弧菌的协同凝集检测试剂盒鉴定了基 础1材料与方法1. 1材料菌株来源:疑似副溶血性弧菌标本92份，取自 2007年7〜9月间医院就诊病人按培养检测法接种碱性蛋 白腺水37*增菌鉴定阳性对照本院检验室提供，菌液浓度 为1.3X108 cfu/mLo大肠埃希菌20份，伤寒沙门菌10份由 本科细菌室提供免疫原与反应原：将培养后副溶血性弧菌 用0. 5%的甲醛PBS配成浓度约10亿/mL的菌液，作为接种家 兔用的免疫原，同时也作为试管凝集反应的反应原动物:体 重2 kg以上的雄性健康家兔10只，免疫接种前经检测血清 副溶血性弧菌抗体滴度均为阴性富含SPA的葡萄球菌购自 晶美公司1. 2副溶血性弧菌多抗血清的制备采用睾丸内接种法, 双侧睾丸各注射0.5mL同种免疫原8只家兔分别用经甲醛 处理的4株副溶血性弧菌免疫原,2只家兔用经紫外线处理的 1株免疫原进行免疫接种，一次接种后，定期采血检测抗体滴 度，观察抗体涨消情况，待抗体滴度明显下降后，进行再次睾 丸免疫接种，并观测动物的回忆应答副溶血性弧菌抗血清 滴度测定法：血清从1 : 20开始用生理盐水做倍比系列稀释, 用试管凝集反应检测血清中副溶血性弧菌的抗体滴度，同时 附有各反应原与生理盐水对照，观测结果，出现++以上凝集 强度的血清最高稀释度为该血清的抗体滴度。

1.3检测试剂的制备1. 3. 1SPA菌体试剂的制备将标准菌株接种于葡萄糖-酵 母沁膏-酷蛋白豚琼脂培养基上37*培养18〜24h,用无菌 的0.01 mol/L,pH 7.2 PBS洗下菌苔，制成均匀悬液3 000 r/min离心20 min,弃上清用PBS细菌离心沉淀洗涤2次 后，混悬于含0.5%甲醛的PBS内，置于室温3 ho用PBS再离 心沉淀洗涤3次后，制成10%细菌悬液(W/V) o置801水浴中 加热20〜30 mino用PBS再次离心沉淀洗涤3次后，制成10% SPA菌体试剂，加入0. 1% NaN3,4°C保存1.3.2协同凝集试剂的制备取10%SPA菌体悬液1 mL,加 和特异性抗血清0.1讥,充分混匀，放37* 1 h,然后置4* 冰箱内过夜3 000 r/min离心20 min,吸出上清用0.01 mol/L,pH 7.2 PBS离心沉淀洗涤2次后，配成1%抗体致敏的 SPA试剂，4*保存1. 4协同凝集实验的建立在洁净的载玻片上加一小滴 生理盐水，加入少量待检细菌制成均匀悬液加一滴特异性 抗体致敏的SPA试剂，充分混合,3 min后观察结果同时作 生理盐水对照及用正常兔血清处理的SPA菌体悬液对照。

出 现肉眼可见的颗粒状凝集，液体变清者(++)为阳性5 min后 仍无凝集现象者为阴性生理盐水对照及未致敏SPA菌体对 照应为阴性，无自凝现象发生2实验结果2. 1VP多抗的鉴定结果BTV多抗鉴定浓度为2. 75 mg/mL, ELISA 效价为 104o2.2协同凝集实验敏感性检测结果阳性对照用碱性蛋白 腺水倍比稀释至2.0X106 cfu/mL时仍出现清晰的凝集颗 粒2. 3协同凝集实验特异性检测结果75份其他肠道杆菌标 本，其中大肠埃希菌20份，伤寒沙门菌20份,各取少许菌落 接种碱性蛋白牒水37工增菌6 h,隔水煮沸15 min,冷至室 温后按上法进行检测，结果均为阴性2.4协同凝集实验稳定性检测结果将菌体试剂置4*冰 箱1年，其对阳性对照测定的敏感性基本不变2. 5协同凝集实验与培养法结果的比较112份临床标本, 培养法阳性64份，协同凝集法检测,62份阳性，1份阴性，另1 份出现非特异性凝集培养法阴性48份,协同凝集法均阴性 与培养法相比较，协同凝集试验的特异性、敏感性、诊断符 合率分别为 100%、94.2%、97. 3%o3讨论本研究从观察睾丸免疫接种后抗体涨消规律入手，探讨 此种免疫法快速制备副溶血性弧菌抗血清的可能性，实验结 果显示,4株菌分别首次接种的家兔于7〜10 d血清抗体滴度 达到高峰，与俄国学者在制备伤寒沙门氏抗血清的研究所获 得的结果相似。

很显然，此法具有操作简易，免疫次数少，节 约免疫原，速效等优点，是一个值得推荐的免疫方法至于睾 丸免疫法为何有如此好的结果，其机理有待进一步研究阐 明除应用甲醛处理的免疫原外，同时还应用了紫外线照射 处理的免疫原，以比较二者的免疫效果曾有学者指出，甲醛 处理细菌能破坏其表面的蛋白质构型，损伤免疫原，而紫外 线是作用核酸，不损伤细菌蛋白质，所以细菌的免疫原性较 强本实验的结果中，虽经紫外线处理的副溶血性弧菌获得 了较好的免疫效果，但由于所用动物太少，是否优于甲醛处 理的免疫原，尚需要做更多的试验比较，方能定论副溶血性弧菌再次免疫家兔后的抗体主要IgG,SPA具有能与特异性抗体IgG的Fc段结合的特性，结合后抗体的功能 区暴露在葡萄球菌表面，仍然保持与相应抗原特异性结合的 特性，且以葡萄球菌为载体，可出现肉眼可见的凝集，该法特 异、灵敏、简便、快速,尤其适合海上舰艇人员感染的初步 检测但由于本实验所检测的菌株菌种数较少，且无其他致 病弧菌做对照，以及对临床标本的处理等问题仍然需要进一 步探讨気善参考文献[l] Bewley,Tam,et al. Detection of total andhemolysin^producingV ibrio phrahaem olyticus in shellfish usingmultip lex PCR amp lification of tl, tdh and tr[J]. JMicrobiolMeth,1999, 36：215-225.[2] Ghosh AR,Sehgal SC.Detection of tdh and trh genes in a urea-hydrolysing environment isolate of V ibrio parahaem olyticus from the andamans[J]・Diarrhoeal Dis Res,1998,16：87~90.[3] Iida T,Park KS,Suthienkul 0,et al.Closeproximity of the tdh,trh and ure genes on chromosome of Vibriophrahaemo-1yticus[J]. Microbiology,1998,144：2517-2523.[4] Suthienkul 0,Iida T,Park KS,et al. Restrietion fragment length polymorphism of the tdh and trh genes in clinical Vibrio phrahaem olyticusstrains]〕]・J ClinMicrobiol,1996,34：1293-1295.[5] Yamamoto K,Honda T,Miwatani T, et al. Enzyme-labeledoligonucleotide probe for the detection of the genes for ther-mostable direct hemolysin(TDH) and TDH-related hemolysin(TRH) of Vibrio phrahaem olyticus[J]・Can J Microbiol,1992,38:410-416・[6] Depaola A,JL Nordstrom,JC Bowers,et al. Seasonal abundance of total and pathogenic V ibrio pa。