B遗传物质的结构和性质徐晋麟分子生物学.ppt

B型型DNA仅仅仅仅是众多是众多DNA双螺旋构象双螺旋构象中的一种中的一种在外界条件在外界条件的改变下，的改变下，双螺旋的构双螺旋的构象也会改变象也会改变1模型中的碱基配对有何重要性？①A-T,G-C配对可形成很好的线性氢键；②A-T对和G-C对的几何形状一样，使双链距离相近，使双螺旋保持均一；③碱基对处在同一平面内不论核苷酸的顺序如何，都不影响双螺旋的结构；④为DNA半保留复制奠定了基础 2 第三节DNA的结构和性质的结构和性质 一．一．DNA二级结构的稳定因素二级结构的稳定因素 (1)碱基对之间的氢键 (2)碱基的堆集力 它包括： ① 疏水作用； ② 范德华力； ③ 磷酸基的负电荷斥力；4腺苷腺苷(AR) 脱氧胞苷脱氧胞苷(dCR)β1’,N9-糖苷键糖苷键 β1’,N1-糖苷键糖苷键β1’β1’N9N1C2C46二二. 双螺旋结构的构象变异双螺旋结构的构象变异DNA的构象现已知有A，B，C，D，E，T，Z 7种。

引起DNA双链构象改变有以下因素：（1）核苷酸顺序；（2）碱基组成；（3）盐的种类；（4）相对湿度7Z-DNA的发现：1972年 Pohl et al 发现 poly(dG-dC)在高盐下旋光性发生改变；1979年 Wang A.H-J(王惠君), A.Rich对 d(CGCGCG)单晶作X衍射分析提出Z－DNA模型8三三 左旋左旋DNA（一）Z-DNA的结构特点：（1）糖磷骨架呈“之”字形（Zigzag）走向2）左旋 (3) G的糖苷键呈顺式(Syn) ，使G残基位 于分子表面4）分子外形呈波形 (5) 大沟消失，小沟窄而深 (6) 每个螺旋有12bp9bb目目前前已已知知DNADNA双双螺螺旋旋结结构构可可分分为为A A、、B B、、C C、、D D及及Z Z型型等等数数种种，，除除Z Z型型为为左左手手双双螺螺旋旋外外，，其其余余均均为为右右手手双双螺螺旋 Z-DNA B-DNA 10 生化专业术语委员会 建议用俯视图(N9 9→C1 1’)q q=0=0°±90 ° °±90 ° 时为顺式时为顺式( (synsyn) )q q=180=180°±90 ° °±90 ° 时为反式时为反式(anti)(anti)嘌呤核苷的扭转角为嘌呤核苷的扭转角为X(CX(C4 4,N,N9 9，，C C1 1’,0)’,0)；；嘧啶核苷的扭转角嘧啶核苷的扭转角为为X(CX(C2 2,N,N1 1，，C C1 1’,0)’,0)。

习惯用法是：习惯用法是：X= X= – –6060 °~ °~0 0 °~120 ° °~120 °为顺式；为顺式； X=X=120 ° ~18120 ° ~180 0 ° ° ~ –~ –6060 ° °为反式；为反式；-60 ° °-60 ° °0° ° 90° °0° °120° °-90° °180° °90° °120° °180° °-90° °嘌呤嘌呤 C4嘧啶嘧啶C2顺式顺式反式反式1113Z－DNA存在的条件： (1) (1) 高盐：高盐：NaCl>2Mol/L, MgCl2>0.7NaCl>2Mol/L, MgCl2>0.7 Mol/LMol/L (2) Pu,Py (2) Pu,Py相间排列：相间排列：（（3 3）在活细胞中如果）在活细胞中如果m5m5C,C,则无需嘌呤则无需嘌呤- -嘧啶相间嘧啶相间排列，在生理盐水的浓度下可产生排列，在生理盐水的浓度下可产生Z Z型 (4) (4) 在体内多胺化合物，如精胺和亚胺及亚精胺在体内多胺化合物，如精胺和亚胺及亚精胺和阳离子一样，可和磷酸基因结合，使和阳离子一样，可和磷酸基因结合，使B-DNAB-DNA转变成转变成 Z-DNA Z-DNA。

(5) (5)某些蛋白质如某些蛋白质如Z-DNAZ-DNA结合蛋白带有正电荷，结合蛋白带有正电荷，可使可使DNADNA周围形成局部的高盐浓度和微环境周围形成局部的高盐浓度和微环境 (6) (6)负超螺旋的存在负超螺旋的存在14(三)生物学意义(1) (1) 可能提供某些调节蛋白的识别啮齿可能提供某些调节蛋白的识别啮齿 类类动动物物病病毒毒的的复复制制起起始始部部位位有有d d（（GCGC））有有交交替替顺序的存在；顺序的存在；(2)(2)在在SV40SV40的增强子中有三段的增强子中有三段8bp8bp的的Z-DNAZ-DNA存在3)(3)原原生生动动物物纤纤毛毛虫虫，，它它有有大大、、小小两两个个核核，，大大大大核核核核有有转转录录活活性性，，小小小小核核核核和和繁繁殖殖有有关关Z-DNAZ-DNA抗抗体体以以萤萤光光标标记记后后，，显显示示仅仅和和大大核核DNADNA结结合合，，而而不不和和小小核核的的DNADNA结结合合，，说说明明大大核核DNADNA有有Z-DNAZ-DNA的的存存在在，，可能和转录有关可能和转录有关15四、四、DNADNA的三级结构的三级结构所谓所谓所谓所谓DNADNA的三级结构，是指在一二结构基础上的三级结构，是指在一二结构基础上的三级结构，是指在一二结构基础上的三级结构，是指在一二结构基础上的多聚核苷酸链上的卷曲。

在一定意义上，的多聚核苷酸链上的卷曲在一定意义上，的多聚核苷酸链上的卷曲在一定意义上，的多聚核苷酸链上的卷曲在一定意义上，是指双螺旋基础上的卷曲是指双螺旋基础上的卷曲是指双螺旋基础上的卷曲是指双螺旋基础上的卷曲三级结构包括三级结构包括三级结构包括三级结构包括链的扭结链的扭结链的扭结链的扭结和和和和超螺旋超螺旋超螺旋超螺旋或者是单链形或者是单链形或者是单链形或者是单链形成的环或是环状成的环或是环状成的环或是环状成的环或是环状DNADNA中的中的中的中的连环体连环体连环体连环体16 超螺旋超螺旋（Supercoied） 松驰型松驰型松驰型松驰型DNA DNA （（relax formrelax form）超螺旋超螺旋超螺旋超螺旋（（SupercoiedSupercoied）） DNA DNA，， 负超螺旋负超螺旋负超螺旋负超螺旋 正超螺旋正超螺旋正超螺旋正超螺旋 检测检测检测检测DNADNA三级结构的方法：三级结构的方法：三级结构的方法：三级结构的方法： 密度梯度离心 凝胶电泳 电镜观察17（一）（一）DNADNA的超螺旋结构的超螺旋结构18原原原原核核核核生生生生物物物物DNADNADNADNA的的的的三三三三级结构：级结构：级结构：级结构：bb绝绝绝绝大大大大多多多多数数数数原原原原核核核核生生生生物物物物的的的的DNADNADNADNA都都都都是是是是共共共共价价价价封封封封闭闭闭闭的的的的环环环环状状状状双双双双螺螺螺螺旋旋旋旋。

如如如如果果果果再再再再进进进进一一一一步步步步盘盘盘盘绕绕绕绕则则则则形形形形成成成成麻麻麻麻花花花花状状状状的的的的超超超超螺螺螺螺旋旋旋旋三级结构三级结构三级结构三级结构 19超螺旋的定量描叙bbWhite方程： L=T+WbbL（Linking nnmber）：链链环环数数或称拓拓扑扑环环绕绕数数，指cccDNA中一条链绕另一条链的总次数其特点是(1) L是整数；(2) 在 cccDNA中任何拓扑学状态中其值 保持不变；(3) 右手螺旋对L取正值20bbW（Writhing number）：扭扭曲曲数数，即超数旋数bb其特点是：(1)可以是非整数；(2)是变量；(3)右手螺旋时，W取负值21bbT（Twisting number）：缠缠绕绕数数，即双螺旋的圈数bb其特点是： (1) 可以是非整数； (2) 是变量； (3) 右手螺旋时T为正值超螺旋的量度可以用超螺旋的量度可以用超螺旋的量度可以用超螺旋的量度可以用超螺旋密度超螺旋密度超螺旋密度超螺旋密度λλλλ来表示：来表示：来表示：来表示： λ=λ=λ=λ=（（（（L-TL-TL-TL-T））））/T/T/T/T 在天然在天然在天然在天然DNADNADNADNA中，中，中，中， λ λ λ λ约为约为约为约为-0.05-0.05-0.05-0.0522（二）（二）三链和四链三链和四链DNADNA这些这些DNA分子的结构单元分别是分子的结构单元分别是三碱基体三碱基体和和四碱基体四碱基体；；这些碱基体通过这些碱基体通过Watson-CrickWatson-Crick氢键氢键氢键氢键配对和配对和配对和配对和HoogsteenHoogsteen氢键氢键氢键氢键配对相互作用而结合成共平面配对相互作用而结合成共平面配对相互作用而结合成共平面配对相互作用而结合成共平面聚合体：聚合体：聚合体：聚合体：Watson-CrickWatson-Crick－－－－ Hoogsteen HoogsteenWatson-CrickWatson-Crick－－－－reversed Hoogsteenreversed HoogsteenReversed Watson-CrickReversed Watson-Crick－－－－ Hoogsteen HoogsteenReversed Watson-Crick Reversed Watson-Crick －－－－reversed Hoogsteenreversed Hoogsteen23三链三链DNAbb基本结构：基本结构：基本结构：基本结构：• •Py-Pu-PyPy-Pu-Py构象构象构象构象( (如如如如T-A.T, C-G.CT-A.T, C-G.C+ +) )• •Pu-Pu-PyPu-Pu-Py构象构象构象构象( (如如如如A.A-T, G.G-C)A.A-T, G.G-C) 24H|DNA25262728第四节 DNA的变性与复性的变性与复性变性变性（denaturation）或解链解链（melting〕复性复性（renaturation）或退火退火（annealing）成核作用成核作用（nucleation）拉拉链作用拉拉链作用（Zippering）DNA的复性对片段有两个要求： (1) 互补顺序的碰撞和排列； (2) 碱基的正确配对和氢键的形成。

30下列因素可导致下列因素可导致DNADNA变性变性：：bb高温、高温、bb酸、酸、bb碱、碱、bb尿素、尿素、bb甲酰胺甲酰胺DNADNA变性后物理性质发生的变化变性后物理性质发生的变化：：（（1 1）流体力学的性质发生改变：粘度下）流体力学的性质发生改变：粘度下 降，而沉降速度增加；降，而沉降速度增加；（（2 2）提高了对紫外线的吸收能力，此称为）提高了对紫外线的吸收能力，此称为 增色效应增色效应增色效应增色效应（（hyperchromic effecthyperchromic effect）31bb双链DNA的A260=1.00（浓度为50μg/ml时，对波长260nm紫外线的吸收能力）；bb单链DNA的A260=1.37；bb游离碱基或核苷酸的A260=1.60bb解解链链温温度度（melting temperature, Tm）或熔点，Tm是A260的升高达到极大值一半时的温度即是变性温度范围的中点bb影响变性的因素： 外部条件如温度和正离子的浓度 浓度低于浓度低于0.4mol/L0.4mol/L，单价阳离子增高，单价阳离子增高1010倍，倍， T m T m增加增加16.6°16.6°32 内部条件 GC含量及分子类型 当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4℃ 马默多蒂马默多蒂（Marmur-Doty）关系式关系式： Tm = 69.3+0.41(G +C)%， 或 GC%=（Tm-69.3）×2.4433复性动力学公式 C 1 1 C0 0 2 1+KC0 0t1/2 根据复性动力学公式我们可以知到些什么？复性进行一半时 = = 34(1) 单链浓度随着时间的增大而减小；(2）反应速率取决于初始的单链浓度Co；(3) 以反应浓度和COt1/2为座标可绘复性曲线；(4) 通过COt1/2值可测原核生物基因组的大小； 已知大肠杆菌的基因组为已知大肠杆菌的基因组为4.2x104.2x106 6bp, Cbp, CO Ot t1/21/2 = 9M.Sec = 9M.Sec C CO Ot t1/21/2 （任何基因组（任何基因组DNADNA））/9M.sec /9M.sec = = 任何基因组大小任何基因组大小/4.2X10/4.2X106 6bpbp(5)原核生物基因组大小不同，复性曲线也不同；(6) 可用以区分真核生物和原核生物基因组。

35363738 单一顺序和重复顺序 复性动力学曲线的区别bb真核生物的DNA有重复顺序，而原核 生物多为单一顺序1) 单一顺序的复性曲线常只有一个拐点， 而重复顺序常有多个拐点2) COt 比值变化范围 原核生物的COt比值为100, 真核生物的COt比值大于10039404142 影响复性反应的因素(1) DNA片段的大小；(2) DNA的浓度；(3) DNA复杂性;(4) 温度 最佳复性温度一般比Tm低25C5) 盐的浓度： 复性时要求盐的浓度达到足够高;为什么？43在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了呢？可以通过哪些法来检测？(1) 减色效应（hpochromic effcef） 测定光密度，即OD值值（optical density），DNA从单链变成双链，OD260减少30%(2) 羟基磷灰石柱层析 羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢，不易 吸附单链44 第五节 分子杂交分子杂交 分子杂交（molecular hybridization）共同特点是： (1)都是应用复性动力学原理； (2)都必须有探针探针（probe）的存在。

探针就是用同位素或非同位素如荧光染料，生物素等标记的短片段特异DNA或RNA顺序45 常用的分子杂交方法bb一一一一. . 原位分子杂交（原位分子杂交（原位分子杂交（原位分子杂交（in situin situ hybridization hybridization））））bb二二. . 斑点杂交斑点杂交斑点杂交斑点杂交（（dot blottingdot blotting））bb三三三三. . 萨瑟杂交萨瑟杂交萨瑟杂交萨瑟杂交（（ Southern blot Southern blot））bb四四四四. . 诺瑟杂交（诺瑟杂交（诺瑟杂交（诺瑟杂交（Northern hybridizationNorthern hybridization））））bb五五五五. Western blotting. Western blottingbb六六六六. . 电镜观察电镜观察电镜观察电镜观察bb (1) (1) 异异异异 源源源源 双双双双 链链链链 定定定定 位位位位 法法法法 （（ Heferoduplex Heferoduplex mappingmapping））bb (2) (2) R-R-环定位法环定位法环定位法环定位法（（R-loop mappingR-loop mapping））4647484950。