毕赤酵母手册.docx

毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz来源：丁香园 时间：2007-9-5©大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化 及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结 构复杂的蛋白质另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大 肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在包含体的形成虽然 简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及 复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多 是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作但大肠杆菌是原核生物， 不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的 包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白 日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于 培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工， 修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏 蛋白翻译后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对 表达产物的加工修饰能力酿酒酵母(Saccharomyces.Cerevisiae)在分子遗传学方面被 人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主 1981 年酿酒酵母表达了第一个 外源基因 干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、 4、 5、 6］干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实 验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降原因是培养基中 维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、 8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降拷贝数是高 效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降同时，实验室用 培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母(methylotrophic yeast)为代表的第二代酵母表达系统［10］甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等.以Pichia.pastoris (毕赤巴斯德酵母)为宿主 的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。

毕赤酵母系统的广泛应用，原 因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、9、11］； ⑴ 具有醇氧化酶 AOX1 基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一 ⑵ 表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合⑶ 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高⑷ 毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少 对细胞的毒害作用Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具 有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化， 培养方便经济等特点利用强效可调控启动子A0X1，已高效表达了 HBsAg、TNF、EGF、 破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、 实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非 常适宜扩大为工业规模［14］目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近 来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的.Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基 因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品［9、 11］。

近年来， Invitrogon 公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年已经有300多种外 源蛋自在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系统毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记其中，GS115 茵株具有AOX1基因，是Mut+,即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4 基因插入，表型为Muts,即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法 Pichia.pas tor酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外 源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达［15］，包括启动子、外源基因克 隆位点、终止序列、筛选标记等表达载体都是穿梭质粒，先在大肠杆菌复制扩增，然后被 导入宿主酵母细胞为使产物分泌胞外，表达载体还需带有信号肽序列 毕赤酵母表达系统有多种分泌型表达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效分泌表达胞 外表达需要在外源蛋白的 N 末端加上一段信号肽序列，引导重组蛋白进入分泌途径，可使 蛋白蛋白质在分泌到胞外之后获得准确的构型毕赤酵母对外源蛋白自身的信号序列识别能 力差，在本试验中所使用pPICZaA质粒，其信号肽来自酿酒酵母的a-交配因子（a-factor）， 能很好的达到以上的要求。

并且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是 其具有 Zeocin 抗性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利［1、9］pPICZaA质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它的主要特点简介如下：⑴ 具有强效可调控启动子A0X1 （alcohol oxidase，醇氧化酶）；⑵ 具有Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选，即在YPDZ平 板上生长的转化子中， 100％都有外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程［15］在操作过程中,Zeocin也可用来筛选含表达载体pPICZaA的大肠杆菌转化子，不 必另外使用Amp，经济而又简便；⑶ 在表达载体 A0X1 5'端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点，多克隆位点下游有A0X1 3'端终止序列；⑷ 分泌效率强的信号肽 a-factor.In vitrogen公司开发的毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前被应用为最为广泛的酵母表达 系统，其主要的优点有：醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高 外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在同时，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达 后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且．有 利于产物的纯化。

一． 毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制1 ．1 各种母液的配制10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）4°C保存34g酵 母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌500*B （0.02%生物素Biotin） 4C保存 保存期为1年20mg的生物素溶于100ml 水中，过滤除菌100*H （0.4%Histidine组氨酸）4C保存保存期为1年400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50C以促进溶解），过滤除菌10*D （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期为 1 年 200g 葡萄糖溶于 1000ml 水中，灭菌15min 或过滤除菌10*M （5%Methanol甲醇）保存期为2个月将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌10*GY （10%Glycerol甘油）保存期为1年以上将100ml甘油和900ml水混匀后， 高压灭菌或过滤除菌100*AA （0.5% of each Ami no Acid,各种氨基酸）4C保存保存期为1年分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中， 过滤除菌。

1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0）,将 1mol/L 的 K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH,则使用磷 酸和氢氧化钾调节pH1.2 常用溶液及缓冲夜1.2.1碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液：溶液I： 50mmol / L glucose, 100mmol / L EDTA 25mmol / L Tris—HCI (pH 8.0) 溶液 II： 0.2mol / L NaOH, 1% SDS (临用时配制)溶液III： 29.44g KAc, 11.5ml Acetic acid,加 ddH2O 至 100 ml4°C保存1.2.2 10% 甘油 (Glycerol)：将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌保存期为1年以上1.2.3 Rnase-H2O：1ul Rnase 加入 1ml 灭菌 dd H2O4C保存1.2.4 TE缓冲液：10mmol / Tris-CI(pH 8．0), lmmol / L EDTA(pH 8.0)1.2.5 STE 缓冲液：0.1mol / L, 10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0)1.2.6 SCE缓冲液：1mol / L Sorbitol (山梨醇)，10mmol / L 柠檬酸钠，10mmol / L EDTA1.2.7 1M potassium phosphate buffer(pH 6.0)：132 ml 1M KHPO24868 ml 1M KH PO241.2.8 50X TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液，pH 8.0 (1L)：242 g Tris57.1 ml Acetic Acid37.2 g EDTA二．毕赤酵母表达的培养基配制[5]2.1 LB (Luria—Bertani)培养基：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl l%PH 7.0制作平板时加入 2 %琼脂粉。

121 C高压灭菌20min可于室温保存用于培养 pPICZaA 原核宿主菌 TOP10F '时可加入 Zeoci n 25ug / ml2.2 LLB (Low Salt LB)培养基：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl 0.5%PH 7.0制作平板时加入2%琼脂粉121 C高压灭菌20min可于室温保存数月用于培养 pPICZaA原核宿主菌TOP10F'时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4C条件下保存1〜2 周2.3 YPD (又称 YEPD)Yeast Extract Peptone Dextrose Medium(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium， 酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基)Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeoc in 100 pg/ml液体YPD培养基可常温保存;琼脂YPD平板在4°C可保存几个月加入Zeocin 100ug / m, 成为YPDZ培养基，可以4C条件下保存1〜2周2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextros。