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大肠杆菌变种EspA的研究进展【关键词】 大肠杆菌O157: H7;基因，EspA大肠杆菌是最多见的微生物之一，在自然界普遍散布，在动物体 内也存在它具有易培育、生长快、易变异等特点肠出血性大肠杆 菌(enterohemorrhagic , EHEC是大肠杆菌的一个变种，曾在多个国 家暴发流行感染要紧致使腹泻、出血性结肠炎 (hemorrhagiccolitis , HC),并常常伴发溶血性尿毒综合征 (hemolytic uremicsyndrome, HUS)、血栓形成的血小板减少性紫瘢(thrombotic thrombocytopenic purpura , TTP)并发症，严峻要挟着人类的生命 健康［1］人类感染此菌的途径主若是食用或接触污染的牛肉、 蔬菜、水果及水源等1982年，美国第一次从出血性腹泻患者的粪便标本中 分离到该菌，并报导与食用汉堡牛肉饼有关这是人类第一次熟悉到 大肠杆菌O157: H7可作为一种病原菌令人类致病，但现在并无引发 医学界的足够重视尔后，大肠杆菌 O157 :H7引发的感染在美国、加拿大、英国和日本等发达国家迅速增加，慢慢引发普遍重视我国于 1987年由权太叔等第一次从出血性结肠炎患者粪便中分离到O157:H7大肠杆菌。

尔后，福建、浙江、广东、河北、宁夏等十几个 省陆续分离出该菌目前美国、英国、加拿大等国家又显现了新的耐 药性变种［2, 3］,致使了多人死亡因此大肠杆菌致病变种引发了国 内外学者的紧密关注，并对大肠杆菌变种进行了深切的研究现仅以EHEO清型O157: H7为例，对它致病因子m型分泌蛋白即 EspA( Esp 为E. coli secreted protein 缩写)进行综述，为对该菌引发的疾 病进行预防、诊断和医治提供有力的依据和参考1 EspA的研究意义目前，对O157:H7感染尚缺乏有效的防治方式，只能给予对症 医治和适当的抗菌医治，但研究证明抗菌药物可促使 O157 : H7大肠杆菌释放Vero毒素，从而使患者并发HUS勺危险性增加发病机理要 紧通过细菌对上皮细胞粘附和产生毒素两个进程粘附是细菌感染的 第一步当EHEC侵入机体肠腔后，借助菌毛局限性地粘附在盲肠和 结肠上皮细胞的刷状缘上并损害微绒毛，同时紧密地结合在肠上皮细 胞膜的顶端出型EspA在细菌的粘附定植中起到关键作用 EspA形成纤丝样管状结构，在细菌和宿主细胞之间架起一座桥梁，把效应蛋 白转移至宿主细胞表面，对细菌粘附至宿主内皮细胞具有关键性启动 作用，而且EspA具有良好的免疫原性及免疫反映性，能够作为候选 免疫原，用于O157的疫苗研制，在排除定植带来的 A/E(attaching/ effacing) 损伤，缩短感染周期具有较大的应用价值。

2 EspA的基因与分子结构编码EspA的基因要紧存在于染色体上大小为 35kb的被称LEE(locus of enterocyte effacement)的毒力岛上[4], LEE包括 40多个开放阅读框(ORFs),至少5个操纵子，编码EspA的主若是LEE4EspA共578bp,表达的蛋白约为25Kda EHEC的出型分泌系统(typemsecretion system,TTSS) 是特异的，但与细胞壁相连的针状复合体却是保守的此复合体是由 EspA组成的纤丝伸展成的针状物［5,6］它的三维结构由5根EspA纤丝螺旋向前延伸，形成外径为 12nm内径为 的周围密闭的中空螺旋管，外表面布满了螺距为的线性 螺旋组成的脊和梢，脊弯曲成扇形样，是 EspA亚单位的特点与外面相较较，中央的通道是滑腻的［6］EspA纤丝样针状物的长度可由 细菌内EspA亚单位的数量调剂［7］有直接证据证明EspB EspD效 应蛋白是从此管道内被转入到宿主细胞膜上， 并形成3〜5nm的小孔，而其它效应蛋白(Tir , EspF, Map Esp G,EspH, Cif ,和 Esp I/NleA) 沿通道及小孔更易进入宿主细胞［7〜11］。

3 EspA表达的调剂EspA的表达是转录后调控的，需要有适合的环境条件先引发LEE124表达，接着受到 EspA EspB EspD mRNA专录翻译的进一步伐控从牛体内分离出两株野生型 O157 :H7 , 一株为EspD高表达, 一株为低表达，先在M9培育基中培育，然后转入MEM-HEPES培育,EspD高表达株细菌的EspA表达阳性率为70%- 95%而低表达仅为30% Esp表达具有培育基依托性，在 M9大体培育基中不能表达，而MEM2HEP1良培育基那么能增进纤丝样EspA的表达及效应蛋白的分泌碳酸氢根离子加入到 Luria肉汤中能够刺激效应蛋白的分泌［12］°toxB基因与ToxB大质粒上的toxB 基因编码一 362kD的蛋白 ToxB,对ToxB的氨基酸序列与许多粘附因子有同源性， 能增进m型分泌系统分泌粘附因子将 EHEGD157Sakai菌株中的pO157去除而构 建 O157Cu(O15兀ured of pO157)后发觉：①缺失 pO157的 O157Sakai 对宿主细胞的粘附能力下降；②将携带 toxB基因的mini2PO157(pIC137)导入O157Cu后可增强其粘附力；③携带 pIC137的O157Cu 可刺激EspA EspB和Tir的产生及分泌。

目前以为ToxB阻碍m型分 泌系统分泌蛋白质是在转录后水平上发生的［13］EspA的表达具有 时效性在整个对数生长期表达在较高水平，而到了静止期后那么迅 速下降另外，一旦 EspA完成效应蛋白EspB , D及Tir的转运， 为了 intimin 与受体Tir更好地结合以便细菌更紧密地粘附到宿主细 胞，EspA会从细菌表面上脱落，表达也会降低［14］4 EspA在粘附损伤中的作用EspA以多聚体形式存在，形成纤维样管状结构，连接到宿主细 胞表面，EspB EspD通过此通道分泌到宿主细胞，并在细胞膜表面形 成小孔Fivaz 和Vander ［15］发觉止匕EspA EspB EspD蛋白组成 了一个分子注射器(molecular syringe)的结构，EspB和EspD就像注 射器的尖部(tip of molecular syringe) ,能够在宿主细胞膜上形成孔道，然后将Tir注入到宿主细胞膜上intimin 与Tir结合后可引发宿主细胞信号转导反映并致使细胞骨架重排而形成特异性损害［5, 16, 17］实验证明EspA介导细菌对宿主细胞的粘附将 EspA突变 株灌入SPF级ICR封锁群小鼠体内，检测粪便排菌情形，4往后灌入 突变株组无一只小鼠检测出细菌，而野生株那么 28天还能检测到6只小鼠中的5只有细菌排出，通过电镜和免疫荧光技术观看粘附改 变，发觉EspA突变株粘附明显减少。

体外细胞粘附实验也证明对 Hela 细胞的粘附被减弱［18］Robert K. Shaw 和 Sarah Daniell 等［17］ 利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观看到EspA在 红细胞粘附中的作用EspA缺失突变株与红细胞（RBC）混合培育，发 觉RBC不被破坏，而野生株那么显现严峻溶血，证明了 EspA在溶血 中起到重要作用5 O157 EspA的免疫学性质EspA交叉反映性HI型EspA普遍存在于致病性G-杆菌中，在非致病菌肠杆菌 中未见表达对 O157:H7的分子进化研究发觉 EPEC和EHEC的L EE 高度同源［4］Biance C. Neves 等［19］研究了 EPEC十种不同血 清型的EspA分子特点和超微结构，在全数血清型中， EspA多肽序列至少有65%勺一致性其中对O127:H6和O55:H6两种血清型比较分析发觉，二者的EspA多肽序列完全一致；而 O111:H2和O128:H2也至少有95%勺一致性Marita Noguerabenza 等［20］调查了北美的墨 西哥市和弗吉尼亚州诺福克市123名妇女乳液，发觉有90%U上存在 EspA抗体。

因为EspA比其它毒力分子加倍保守，来源不同的多型病 原体的EspA变异体具有结构相似性，抗EspA抗体有多发生率及普遍 的交叉反映，因此EspA抗体提供了对多种血清型普遍交叉的保证作 用通过序列分析显示 O127:H6和O157:H7的EspA具有85%f同，EspA 抗体能够阻止EPEG口 EHEC1多血清型的粘附，不像抗LPS或intimin 抗体仅对有限的肠道病原体有爱惜作用而且EspA是表面表达和多聚 体形式存在，具有良好的免疫原性，抗 EspA抗体常比其它表面蛋白的抗体存在的数量为多；EspA的天然暴露可诱导良好的免疫反映且持 续时刻长，这些因素使它可能成为研制抗 EHECffi EPEC多种血清型疫 苗的有力的候选者以此设计的疫苗相关于 O157 LPS能够提供普遍的交叉爱惜作用［21］但也有报导，EPEC E2348/69和EHEC 85-170 的EspA抗体不具有交叉反映性，尽管它们之间基因同源性较高EHEC O157:H7的EspA能够显著减少家畜的感染，但不能爱惜其它血清型的 感染如 EHEC O26:H11 EHEC O103:H*口 EHEC O111［5］。

因此研制 融合重组的EspA疫苗是超级必要的EspA免疫原性及免疫爱惜性EPEC和EHEC的EspA对人和动物都有免疫原性［22］用EspA重组蛋白成功诱导兔的免疫应答，噬菌体呈现技术显示有相应抗体产生用传统的噬菌体抗体洗脱和菌落过滤器挑选的方式挑选出抗体库，取得EspA特异性抗体识别E. coli O157 的EspA抗体也能 识别来源于eae基因突变缺失的O157DM株和O111株的EspA分泌蛋 白［22］用EspA重组蛋白加VSA2佐齐I」皮下接种已感染 O157:H7的 牛体内，发觉抗EspA抗体滴度比对照组增加13倍，细菌的粪便排泄 显示减少［23］D. Karpman等［24］用免疫印迹的方式研究了 EspA 重组蛋白的血清免疫应答反映，并检测了感染 O157:H7后的病人血清中EspA EspB的抗体，包括三者的IgG,及EspA和EspB的IgA、IgM, 结果显示具有较高的特异性和灵敏性 Yuling li和Elizabeth Frey等［25］观看了人对O157:H7的EspA的免疫应答，方式是用免疫印迹 及ELISA技术检测感染过 O157:H7人血清对纯化的EspA重组蛋白的 免疫反映，结果显示感染8天后的病人血清对EspA有强烈反映，说明 人感染O157:H7后产生了 EspA抗体，揭露EspA可作为研制预防EHEC 感染疫苗的候选抗原分子。

6结语EHEC O157:H7感染尚缺乏有效的医治手腕，研制预防 EHECO157:H7感染的疫苗成为可行而有效的方法细菌粘附是感染的第一 步，若是能阻止细菌的粘附，不仅能够阻止细菌的感染，还能有效地 预防O157感染开始时粘附所造成的A/E损伤EspA是O157引发的A/E 损伤的关键分子，具有良好的免疫性和交叉爱惜性，是研制O157疫苗的重要候选抗原依照EspA结构及表达的特点，在进行O157研究与 疫苗研制进程中需注意以下两点：① EspA分泌表达的时效性因为 EspA具有菌株依托性和生长周期的依托性， 而且在完成效应蛋白的转移后即脱落或消失，因此要操纵好条件以保证细菌 EspA的分泌表达②如何保证天然的构象EspA是一个多聚体，结构较为复杂，天然构 象的改变可能阻碍其活性及免疫特性参考文献】[1] Li Y, Frey E, Mackenzie AM, e。