食品饮料中维生素的测定.ppt
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Determination of Vitamin in Food 第十章第十章 维生素的测定维生素的测定1 第一节第一节 维生素的测定概述维生素的测定概述 维生素是调节人体各种新陈代谢过程必不可少维生素是调节人体各种新陈代谢过程必不可少的重要营养素人体如从膳食中摄入维生素的量不的重要营养素人体如从膳食中摄入维生素的量不足或者机体由于某种原因吸收或合成发生障碍时，足或者机体由于某种原因吸收或合成发生障碍时，就会引起各种维生素缺乏症近几年已经查明仅有就会引起各种维生素缺乏症近几年已经查明仅有少数几种维生素可以在体内合成，大多数维生素都少数几种维生素可以在体内合成，大多数维生素都必须由食物供给因此，维生素作为强化剂已在食必须由食物供给因此，维生素作为强化剂已在食品工业的某些产品中开始使用，测定食品中的维生品工业的某些产品中开始使用，测定食品中的维生素含量，不仅可评价食品的营养价值，同时还起到素含量，不仅可评价食品的营养价值，同时还起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多的维生监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多的维生素而引起中毒，所以，测定食品中维生素在营养分素而引起中毒，所以，测定食品中维生素在营养分析方面具有重要的意义。
析方面具有重要的意义2 脂溶性微生物素脂溶性微生物素（如（如A A、、D D、、E E、、K K等）；等）；水溶性维生素水溶性维生素（如（如B1B1、、B2B2、、B6B6、、C C、、B12B12等）维生素维生素A A：：是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜 炎、夜盲症等疾病炎、夜盲症等疾病维生素维生素B B1 1：：也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经 炎，帮助消化，促进发育炎，帮助消化，促进发育维生素维生素B B2 2：：对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象维生素维生素C C：：防坏血病，促进外伤愈合，使机体增强抵抗力防坏血病，促进外伤愈合，使机体增强抵抗力维生素维生素D D：：调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷的调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷的 代谢，并能防止软骨病代谢，并能防止软骨病 目前已发现的维生素约有二、三十种，按维生素溶解目前已发现的维生素约有二、三十种，按维生素溶解性能可将它们分成两大类：性能可将它们分成两大类：3 维生素的命名维生素的命名 1 1、、 多根据发现的时间顺序以英文字母排序，如多根据发现的时间顺序以英文字母排序，如维生素维生素A A、维生素、维生素B B1 1、、B B2 2，维，维 生生 素素C C，， 维生素维生素E E等。
等 2 2、、 也有根据特定生理功能，如抗干眼病因子、也有根据特定生理功能，如抗干眼病因子、抗坏血酸、生育酚等，抗坏血酸、生育酚等， 3 3、、 按照其化学结构如视黄醇、硫胺素、烟酸、按照其化学结构如视黄醇、硫胺素、烟酸、叶酸等4 脂溶性维生素的理化性质脂溶性维生素的理化性质1 1、结构决定性质，大都具有、结构决定性质，大都具有UVUV吸收的特性！吸收的特性！2 2、、溶溶解解性性：：脂脂溶溶性性维维生生素素不不溶溶于于水水，，易易溶溶于于苯苯、、 乙乙醚醚、、 丙丙酮酮、、三三氯氯甲烷、乙醇等有机溶剂甲烷、乙醇等有机溶剂 3 3、、耐耐酸酸碱碱性性：：维维生生素素A A、、D D对对酸酸（（ACIDACID））不不稳稳定定，，对对碱碱稳稳定定；；维维生生素素E E在无氧情况下，对热、酸、碱稳定维生素在无氧情况下，对热、酸、碱稳定维生素K K 对酸、碱都不稳定对酸、碱都不稳定 4 4、耐热：维生素、耐热：维生素A A、、D D、、E E、、K K耐热性都好，耐热性都好， 5 5、耐光、耐氧化性：、耐光、耐氧化性： 维生素维生素D D性质稳定，不易被氧化。
性质稳定，不易被氧化维生素维生素A A易被氧化，光和热会促进其氧化易被氧化，光和热会促进其氧化 维生素维生素E E容易被氧化，对可见光稳定但易被紫外线破坏容易被氧化，对可见光稳定但易被紫外线破坏维生素维生素K K对热稳定，但容易被光、氧化剂及醇破坏对热稳定，但容易被光、氧化剂及醇破坏这样在提取时，要求尽量避光、并加入抗氧化剂）（这样在提取时，要求尽量避光、并加入抗氧化剂） 5 分析方法分析方法维生素的分析方法可分为以下几种：维生素的分析方法可分为以下几种：（（1 1）涉及人体和动物的生物分析方法涉及人体和动物的生物分析方法2 2）利用原生动物、细菌和酵母的微生物分析方法）利用原生动物、细菌和酵母的微生物分析方法（（3 3）分光光度法、荧光法、色谱、酶法和免疫等物）分光光度法、荧光法、色谱、酶法和免疫等物理化学分析方法理化学分析方法6 脂溶性维生素测定样品预处理 样品样品 皂化脱脂皂化脱脂 脱脂样品脱脂样品 有机溶剂提取有机溶剂提取脂溶性维生素脂溶性维生素 有机溶有机溶剂提取液剂提取液 浓缩测定浓缩测定第二节第二节 脂溶性维生素的测定脂溶性维生素的测定7 一、维生素一、维生素A目前维生素目前维生素A A都是合成的，来源：都是合成的，来源：（（1 1）从动物脂肪中，主要在肝脏，鱼肝油，蛋类，）从动物脂肪中，主要在肝脏，鱼肝油，蛋类，乳类存在；乳类存在；（（2 2）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指类胡萝卜素，主要是类胡萝卜素，主要是β-β-胡萝卜素胡萝卜素, ,存在于深色果存在于深色果蔬中。
蔬中 维生素维生素A A的测定常用的方法有的测定常用的方法有三氯化锑比色三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法8 对于三氯化锑比色法适用于样品中含对于三氯化锑比色法适用于样品中含VAVA高的高的样品，方法简便、快速、结果准确，但是对维样品，方法简便、快速、结果准确，但是对维生素生素A A含量低的样品，如每克样品中含含量低的样品，如每克样品中含5 5～～10μg10μg维生素维生素A A时，这时样品由于受其脂溶性物质的干时，这时样品由于受其脂溶性物质的干扰，不应用比色法测定扰，不应用比色法测定 对于紫外分光光度法不必加显色剂显色，对于紫外分光光度法不必加显色剂显色，可直接测定维生素可直接测定维生素A A的含量，对样品中含的含量，对样品中含VAVA低的低的也可以测出可信结果，操作简便、快速也可以测出可信结果，操作简便、快速9 1、维生素、维生素A的性质的性质⑴⑴ 因有许多不饱和链，故见光易分解；因有许多不饱和链，故见光易分解；⑵⑵ 在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。
如测强化奶粉时，速度要快，一般要求测定时如测强化奶粉时，速度要快，一般要求测定时间短，因为时间长，见光时间长，见光分解，间短，因为时间长，见光时间长，见光分解，故测出的比出厂的含量要少；故测出的比出厂的含量要少；⑶⑶ 对碱稳定；对碱稳定；10 2. 2. 测定方法测定方法2.1 2.1 三氯化锑光度法三氯化锑光度法P197P1972.1.1 2.1.1 测定原理测定原理 在氯仿溶液中，维生素在氯仿溶液中，维生素A A与三氯化锑作用可生与三氯化锑作用可生成蓝色可溶性络合物，在成蓝色可溶性络合物，在620nm620nm波长处有最大吸收波长处有最大吸收峰，其蓝色的深浅与维生素峰，其蓝色的深浅与维生素A A的含量在一定范围内的含量在一定范围内成正比，故可通过吸光度测定维生素成正比，故可通过吸光度测定维生素A A的含量 11 原理图示维生素维生素A+A+三氯化锑三氯化锑氯仿溶液中兰色可溶性配合物兰色可溶性配合物620nm波长比色波长比色12 试剂试剂无水硫酸钠、乙酸酐无水硫酸钠、乙酸酐无水乙醚（不含过氧化物）无水乙醚（不含过氧化物）无水乙醇（不含醛类物质）无水乙醇（不含醛类物质）三氯甲烷（不含分解物和水）三氯甲烷（不含分解物和水）250g/L250g/L三氯化锑三氯化锑——三氯甲烷溶液三氯甲烷溶液1+11+1氢氧化钠溶液、氢氧化钠溶液、0.5mol/L0.5mol/L氢氧化钾氢氧化钾13 样品预处理样品预处理样品测定样品测定①①样品预处理样品预处理含有维生素含有维生素A A的样品大多需首先除去脂肪，把维生的样品大多需首先除去脂肪，把维生素素A A从脂肪中分离出来。
常规的去脂方法是采用从脂肪中分离出来常规的去脂方法是采用皂皂化法和研磨法化法和研磨法2.1.2 测定步骤测定步骤14 A A脂类的皂化脂类的皂化P197P197 (1) (1) 脂类含有维生素和脂肪这两部分，通过脂类含有维生素和脂肪这两部分，通过皂化（皂化（50%KOH50%KOH、无水、无水C C2 2H H5 5OHOH、热回流）把它们、热回流）把它们分开，得到一部分皂化物和一部分不皂化物分开，得到一部分皂化物和一部分不皂化物15 ⑵⑵适用范围适用范围适用于维生素适用于维生素A A含量不高的样品，但全部试验过程费时，含量不高的样品，但全部试验过程费时，且易导致维生素且易导致维生素A A的损失16 目前皂化有三种情况：目前皂化有三种情况：低碱低碱 = 脂肪脂肪︰︰KOH为为1︰︰2.5的关系的关系 另外在皂化时加抗氧化剂与不加抗氧化剂回收率不一样，加抗氧另外在皂化时加抗氧化剂与不加抗氧化剂回收率不一样，加抗氧化剂的回收率高于不加抗氧化剂的回收率化剂的回收率高于不加抗氧化剂的回收率 低温（室温）低温（室温） 中温中温（（70℃±2℃70℃±2℃））高温高温（（100℃15min100℃15min））低碱低碱低碱低碱低碱低碱回收率不完全回收率不完全 回收率回收率46%46%回收率回收率70%70%17 （（3）提取）提取 将皂化液移入分液漏斗，先用将皂化液移入分液漏斗，先用50ml水分两次冲洗皂化瓶，水分两次冲洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。
再用洗液并入分液漏斗再用 100ml乙醚分两次冲洗皂化瓶，乙醚分两次冲洗皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗，振摇所有洗液并入分液漏斗，振摇2min，提取不皂化部分提取不皂化部分静止分层后，水层放入第二分液漏斗皂化瓶再用静止分层后，水层放入第二分液漏斗皂化瓶再用 30ml乙醚分两次冲洗，洗液倾入第二分液漏斗，振摇后静止分乙醚分两次冲洗，洗液倾入第二分液漏斗，振摇后静止分层，将水层放入第三分液漏斗，醚层并入第一分液漏斗层，将水层放入第三分液漏斗，醚层并入第一分液漏斗如此重复操作，直至水层不再使三氯化锑一三氯甲烷溶液如此重复操作，直至水层不再使三氯化锑一三氯甲烷溶液呈蓝色为止合并乙醚层后，先用水洗提后，再用呈蓝色为止合并乙醚层后，先用水洗提后，再用0.5mol/LKOH溶液洗涤除去醚溶性酸皂，再用水洗涤醚溶液洗涤除去醚溶性酸皂，再用水洗涤醚层，直到洗涤水不呈碱性（用酚酞指示剂指示）为止层，直到洗涤水不呈碱性（用酚酞指示剂指示）为止18 （（4）浓缩）浓缩 将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约15ml乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内。
用角瓶内用55度水浴蒸馏，回收乙醚待瓶中剩约度水浴蒸馏，回收乙醚待瓶中剩约5ml乙醚时取下减压抽干，立即准确加入一定量乙醚时取下减压抽干，立即准确加入一定量三氯甲烷（约三氯甲烷（约5ml左右），使溶液中维生素左右），使溶液中维生素A含量在含量在适宜浓度范围内适宜浓度范围内(3～～5μg）19 2.1.3 2.1.3 计算计算SbCl3比色法比色法 维生素维生素A／／CHCl3 ＋＋ SbCl3／／CHCl3→形成兰色物形成兰色物质质→在在620nm有最大吸光峰有最大吸光峰 这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线计算：每百克样品含计算：每百克样品含VA的量的量= C×（（V1/V2））×（（100/W）） C ：从标准曲线上查得：从标准曲线上查得VA的量的量 V1 ：： CHCl3定容的量定容的量 V2 ：： 测定所取样液体积测定所取样液体积20 B B、研磨法、研磨法 适用于每克样品维生素适用于每克样品维生素A A的含量大于的含量大于5 5～～10μg10μg样品的测定，如猪肝的分析。
步骤简单、省时，样品的测定，如猪肝的分析步骤简单、省时，结果准确结果准确研磨研磨 精确称取精确称取2 2～～5g5g样品，放入盛有样品，放入盛有3 3～～5 5 倍样品质倍样品质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化收，并均质化21 提取提取 小心地将全部均质化的样品移入带盖的三角瓶小心地将全部均质化的样品移入带盖的三角瓶内，准确加入内，准确加入5050～～100ml100ml乙醚紧压盖子，用力振摇乙醚紧压盖子，用力振摇2min2min；静置澄清（大约需；静置澄清（大约需1 1～～2 h2 h），或离心澄清（保），或离心澄清（保持低温）持低温）浓缩浓缩 取澄清提取乙醚液取澄清提取乙醚液2 2～～5m15m1，放入比色管中，在，放入比色管中，在7070～～80℃80℃水浴上抽气蒸干；然后立即加入水浴上抽气蒸干；然后立即加入lmllml三氯甲烷三氯甲烷溶解残渣，供比色用溶解残渣，供比色用22 ②②标准曲线的绘制标准曲线的绘制6个个3cm比色管编号比色管编号 1 2 3 4 5 6加各种浓度加各种浓度VA标液标液1ml 10 20 30 40 50 60 ug/ml乙酸酐（滴）乙酸酐（滴） 1 1 1 1 1 1于于620nm620nm波长处，以波长处，以 10ml10ml三氯甲烷加三氯甲烷加1 1滴乙酸酐调节吸光度至零滴乙酸酐调节吸光度至零点；然后将标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入点；然后将标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入9ml9ml三氯三氯化锑一三氯甲烷溶液，于化锑一三氯甲烷溶液，于6s6s内测定吸光度（每支比色管都在临内测定吸光度（每支比色管都在临测前加入显色剂）。
以维生素测前加入显色剂）以维生素A A含量为横坐标，以吸光度为纵坐含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制曲线标绘制曲线23 2.1.32.1.3样品测定样品测定 取两个取两个3cm3cm比色管，其中一个加入比色管，其中一个加入10ml10ml三三氯甲烷（样品空白液）和氯甲烷（样品空白液）和1 1滴乙酸酐作为空白滴乙酸酐作为空白液；另一支加入液；另一支加入lmllml样品溶液，再加样品溶液，再加1 1滴乙酸滴乙酸酐其余步骤同标准曲线的制备分别测定酐其余步骤同标准曲线的制备分别测定样品空白液和样品溶液的吸光度，从标准曲样品空白液和样品溶液的吸光度，从标准曲线中查出相应的维生素线中查出相应的维生素A A含量24 2.1.4计算计算式中式中 χ---维生素维生素A含量含量,单位单位mg/100g；； c----由标准曲线上查得样品溶液中维生素由标准曲线上查得样品溶液中维生素A的含量，的含量，μg/ml；； c0----由标准曲线上查得样品空白液中维生素由标准曲线上查得样品空白液中维生素A的含的含量，量，μg/ml；； m----样品质量，样品质量，g；；’ V----样品提取后加入三氯甲烷定容之体积，样品提取后加入三氯甲烷定容之体积，ml；； 100----以每以每100g样品计。
样品计25 说明及讨论说明及讨论（（1）本法摘自）本法摘自GB12388-1990，适用于食品中维，适用于食品中维生素生素A的测定的测定（（2）） SbCl3 具有腐蚀性，不能粘在手上且与具有腐蚀性，不能粘在手上且与水生成白色沉淀，所以不能碰到水水生成白色沉淀，所以不能碰到水3）） SbCl3 与维与维 生素生素A生成的蓝色物质很不稳生成的蓝色物质很不稳定，要在定，要在6S内完成吸光度的测定，否则蓝色反内完成吸光度的测定，否则蓝色反应逐渐消失，使结果偏低应逐渐消失，使结果偏低4）维生素）维生素A 见光易分解，整个实验应在暗处见光易分解，整个实验应在暗处进行进行（（5 5）本法适用于维生素）本法适用于维生素A A 含量较高的样品含量较高的样品26 紫外吸收光谱：分子价电子能级跃迁紫外吸收光谱：分子价电子能级跃迁波长范围：波长范围：100-800 100-800 nm.nm.(1) (1) 远紫外光区远紫外光区: : 100-200100-200nm nm (2) (2) 近紫外光区近紫外光区: 200-400: 200-400nmnm(3)(3)可见光区可见光区:400-800:400-800nmnm 250 300 350 400nm1234e eλ 可用于结构鉴定和定量分析。
可用于结构鉴定和定量分析 电子跃迁的同时，伴随着振动电子跃迁的同时，伴随着振动转动能级的跃迁转动能级的跃迁; ;带状光谱带状光谱2 测定方法测定方法2.2 紫外分光光度法紫外分光光度法紫外吸收光谱的产生紫外吸收光谱的产生27 Lamber-BeerLamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律定律：吸收光谱法基本定律Ø描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系的关系假设一束平行单色光通过一个吸光物体假设一束平行单色光通过一个吸光物体 28 紫外分光光度法测定维生素紫外分光光度法测定维生素A A E是吸收系数是吸收系数原理：原理：VA为脂溶性的，测定为脂溶性的，测定VA时必须先将样品时必须先将样品中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化部中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化部分，在经柱层析除去杂质等干扰物质，在紫分，在经柱层析除去杂质等干扰物质，在紫外外328nm下测定，求出含量下测定，求出含量29 o方法方法o 1）） 提取及皂化提取及皂化 :称样称样10.00g → 于烧杯中于烧杯中 → 加加40ml水搅匀水搅匀 → 移移250ml分液漏斗中分液漏斗中 → 加氨水加氨水5ml→ 加乙醇加乙醇35ml → 摇匀摇匀 → 用乙醚抽提（每次用乙醚抽提（每次40ml抽提三次）抽提三次） → 收集乙醚层收集乙醚层 → 用用10ml水洗乙醚层三次水洗乙醚层三次 →水层再用水层再用30ml乙醚抽提一次乙醚抽提一次 → 合并所用乙醚合并所用乙醚 → 用索氏法除乙用索氏法除乙醚醚→ 待瓶中乙醚除尽后待瓶中乙醚除尽后 → 加加30ml80%的的KOH → 40mlC2H5OH →加加0.8g焦性没食子酸焦性没食子酸 → 83℃℃水浴水浴30分分钟（皂化脂肪）钟（皂化脂肪）→ 冷却后移入冷却后移入250ml分液漏斗中分液漏斗中 → 加加60ml水水 → 用用40ml乙醚抽提三次乙醚抽提三次 →合并乙醚抽提液合并乙醚抽提液 → 用水洗至中性用水洗至中性 → 用索氏法除乙醚用索氏法除乙醚 → 除去后用除去后用5ml石油石油醚溶解瓶中内容物醚溶解瓶中内容物 → 然后移入刻度试管中然后移入刻度试管中 30 2 2）层析）层析 在在层层析析柱柱内内装装8 8cmcm高高度度中中性性氧氧化化铝铝 → → 2 2cmcm高高度度碱碱性性氧氧化化铝铝及及1 1cmcm无无水水硫硫酸酸钠钠 → → 以以石石油油醚醚浸浸透透 → → 装装皂皂化化后后的的样样液液慢慢慢慢于于柱柱内内→ → 用用1 1～～2 2mlml石石油油醚醚洗洗试试管管 → → 洗洗液液倒倒入入柱柱内内，，活活塞塞打打开开以以每每分分钟钟为为3535滴滴左左右右的的速速度度打打开开，，当当液液面面降降到到接接近近硫硫酸酸钠钠时时 → → 加加5 5mlml石石油油醚醚→ → 随随后后用用5 5mlml洗脱液逐次洗涤。
洗脱液逐次洗涤 层层析析柱柱上上第第一一个个黄黄色色层层析析层层，，一一般般是是β-β-胡胡萝萝卜卜素素，，此此带带在在12%12%洗洗脱脱液液前前后后洗洗去去，，收收集集于于1010mlml容容量量瓶瓶中中直直到到流流出出物物不不呈呈黄黄色色为为止止，，此此层层可可测测β-β-胡胡萝萝卜卜素素用用，，而而V VA A一一般般在在50%50%洗洗脱脱液液洗洗出出，，用用2 2mlml刻刻度度吸吸管管收收集集1 1mlml吸吸约约0.20.2mlml于于小小试试管管中中→→加加0.30.3ml25%ml25%三三氯氯化化锑锑→→溶溶液液如如呈呈兰兰色色→→表明有表明有V VA A存在，故存在，故0.50.5mlml用石油醚定容用石油醚定容1010mlmlb. b. 方法方法31 二、维生素二、维生素D D 1.维生素维生素D的性质的性质 维生素维生素D是类固醇的衍生物，具有维生素是类固醇的衍生物，具有维生素D活性的物质约活性的物质约10余种，在功能上可以防治佝偻病余种，在功能上可以防治佝偻病其中最主要的是维生素其中最主要的是维生素D2(麦角钙化醇麦角钙化醇)和维生素和维生素D3(胆钙醇胆钙醇)。
是由维生素是由维生素D原经紫外线照射形成原经紫外线照射形成的 维生素维生素D在鱼肝油和鸡蛋黄等食品中含量较在鱼肝油和鸡蛋黄等食品中含量较多，一般成人不会缺多，一般成人不会缺VD，而婴儿容易缺乏而婴儿容易缺乏 维生素维生素D D2 2 药片吃多了中毒药片吃多了中毒32 2. 测定方法测定方法2.1 三氯化锑光度法三氯化锑光度法 原理：原理：在三氯甲烷溶液中，维生素在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑与三氯化锑结合生成一种结合生成一种橙黄色橙黄色化合物，并于化合物，并于500nm波长处波长处有一个最大吸收，其呈色程度与维生素有一个最大吸收，其呈色程度与维生素D含量成含量成正比 维生素维生素D／／CHCl3 ＋＋ SbCl3／／CHCl3→ 形成橙黄色形成橙黄色物质物质 → 500 nm下测定下测定 33 说明说明 食品中维生素食品中维生素D D含量一般较低，而其他维含量一般较低，而其他维生素及物质含量大于维生素生素及物质含量大于维生素D D，对测定产生干，对测定产生干扰，测定前必须经柱层析除去这些物质。
扰，测定前必须经柱层析除去这些物质 此法测定值为此法测定值为D D2 2和和D D3 3的总量34 2.2 紫外分光光度法紫外分光光度法 VD／乙醇／乙醇 → 265 nm下测定下测定35 2.3 2.3 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC））基本原理基本原理：试样在焦性没食子酸的保护下皂：试样在焦性没食子酸的保护下皂化，用石油醚萃取不皂化物，萃取物经正化，用石油醚萃取不皂化物，萃取物经正相色谱柱分离富集，再用反相色谱柱进一相色谱柱分离富集，再用反相色谱柱进一步分离，紫外检测器测定，与标准试样比步分离，紫外检测器测定，与标准试样比较定量36 三、 β-胡萝卜素的测定P198o （（GB/T 5009.83—2003 ）第一方法是）第一方法是HPLC；；o 第二方法为纸层析法第二方法为纸层析法o胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，其中在分子结构中含有卜素，其中在分子结构中含有 β一紫罗宁残基的类一紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转变为维生素胡萝卜素，在人体内可转变为维生素A，故称为维，故称为维生素生素A原。
如原如α、、β、、γ胡萝卜素，其中以胡萝卜素，其中以β—胡萝卜胡萝卜素效价最高素效价最高37 胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色而添加胡萝卜素的食品，当然产品，以及为着色而添加胡萝卜素的食品，当然也含有胡萝卜素也含有胡萝卜素38 胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏因系脂镕性维和空气中的氧可促进其氧化破坏因系脂镕性维生素，故可用有机溶剂从食物中提取生素，故可用有机溶剂从食物中提取 胡萝卜素本身是一种色素，在胡萝卜素本身是一种色素，在450 nm 波长波长处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、定量但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取叶黄素等共存，在提取 β一胡萝卜素时，这些色一胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其它色素分开。
常用的方法有纸层析、胡萝卜素与其它色素分开常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法柱层析和薄层层析法39 第三节第三节 水溶性维生素的测定水溶性维生素的测定一、维生素一、维生素B B1 1的测定的测定VBVB1 1又叫硫胺素又叫硫胺素1 1、食品中、食品中VBVB1 1的存在形式的存在形式⑴ ⑴ 常以游离态存在；常以游离态存在；⑵⑵复合脂形式存在（磷蛋白）；复合脂形式存在（磷蛋白）；⑶ ⑶ 辅羧酶形式存在辅羧酶形式存在 VB VB1 1在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色的蔬菜和牛乳、蛋黄中比较丰富，动物组织不如植物的蔬菜和牛乳、蛋黄中比较丰富，动物组织不如植物含量丰富含量丰富40 2 2、、VBVB1 1的性质的性质⑴ VB⑴ VB1 1在中性、碱性下不稳定，易分解；在中性、碱性下不稳定，易分解；⑵ VB⑵ VB1 1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定；稳定；⑶ VB⑶ VB1 1为白色结晶，微溶于为白色结晶，微溶于C C2 2H H5 5OHOH，不溶于乙，不溶于乙醚或醚或CHClCHCl3 3，易溶于水。
易溶于水41 3、、VB1的测定的测定世界各国都用世界各国都用荧光比色法荧光比色法测定测定P202⑴ ⑴ 原理原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被氧化成一种蓝色荧光物质，即为硫色被氧化成一种蓝色荧光物质，即为硫色素，在紫外光下，硫色素发出荧光素，在紫外光下，硫色素发出荧光 42 o ⑵⑵ 方法方法o(a) 提取提取o称取一定量的试样，加称取一定量的试样，加0.3mol/LHCl溶液使其溶溶液使其溶解后置于解后置于103KPa压力锅中水解，冷却后中和至压力锅中水解，冷却后中和至pH=4.5，，用淀粉酶使淀粉水解，也可用磷酸酶用淀粉酶使淀粉水解，也可用磷酸酶使淀粉水解，于使淀粉水解，于50℃℃恒温箱中恒温箱中12小时小时 ，使硫胺素游离出来43 o（（b）纯化）纯化（采用柱层析提纯）（采用柱层析提纯）o 吸附剂采用的是人造浮石人造浮石用吸附剂采用的是人造浮石人造浮石用25%KCl溶溶液分数次洗涤，主要是把液分数次洗涤，主要是把VB1吸附上去，吸附上去后，吸附上去，吸附上去后，再用热水淋洗，最后用再用热水淋洗，最后用25%KCl-HAC把把VB1洗脱下来，洗脱下来，这样就得到纯这样就得到纯VB1，，再根据上面的原理在碱性下分析。
再根据上面的原理在碱性下分析o（（c)氧化氧化o分别取分别取A,B两个两个Maizel-Gerson反应瓶，各加反应瓶，各加5mL试样试样净化液，净化液，A瓶加瓶加3mL15g/100mL氢氧化钠溶液（试剂氢氧化钠溶液（试剂空白），空白），B瓶中加瓶中加3mL碱性铁氰化钾溶液（试样），碱性铁氰化钾溶液（试样），于相同条件下震摇，各加于相同条件下震摇，各加10mL正丁醇萃取同样步骤正丁醇萃取同样步骤做标准硫胺素应用液的氧化和提取，分离出萃取液后做标准硫胺素应用液的氧化和提取，分离出萃取液后供测荧光强度供测荧光强度44 oMaizcl-Gerson反应瓶 45 （（2 2）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法： 配配制制一一系系列列标标准准浓浓度度试试样样测测定定荧荧光光强强度度，，绘绘制制标标准准曲曲线线，，再再在在相相同同条条件件下下测测量量未未知知试试样样的的荧荧光光强度，在标准曲线上求出浓度强度，在标准曲线上求出浓度46 二、维生素维生素B B2 2的测定的测定P204P204（（1））VB2的特性（的特性（Properties of VB2））①①对热稳定，对酸和中性对热稳定，对酸和中性pH也稳定也稳定,在在120 ℃加热加热6h仅少量破坏。
仅少量破坏②②在碱性条件下迅速分解在碱性条件下迅速分解③③在光照下转变为光黄素和光色素在光照下转变为光黄素和光色素,并产生自由基并产生自由基,破坏其它营养成分产生异味破坏其它营养成分产生异味,如牛奶的日光臭味如牛奶的日光臭味即由此产生即由此产生2）测定方法有荧光法和高效液相色谱法测定方法有荧光法和高效液相色谱法47 48 三、维生素三、维生素C的测定的测定 P206 维生素维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多它是氧化还原酶之一，本柑橘等食品中含量较多它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂 49 维生素维生素C（还原型）纯品为白色无臭结晶，（还原型）纯品为白色无臭结晶，熔点熔点190～～192℃，溶于水或乙醇中，不溶于，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。
在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易油剂在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始氧开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）如果进化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）如果进一步水解则生成一步水解则生成2，，3-二酮古乐糖酸，失去生二酮古乐糖酸，失去生理作用50 根据它具有的还原性质可以测定维生素根据它具有的还原性质可以测定维生素C的的含量常用的测定方法有含量常用的测定方法有（（1））2，，6-二氯靛酚法二氯靛酚法 （还原型（还原型VC））（（2））2，，4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （总（总VC））（（3）碘酸法）碘酸法（（4）碘量法）碘量法（（5）荧光法）荧光法51 1. 2，，6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法P2091、原理：、原理：还原型抗坏血酸还原染料还原型抗坏血酸还原染料2，，6-二氯靛酚，二氯靛酚，该染料在酸性中呈红色（在中性和碱性条件下呈该染料在酸性中呈红色（在中性和碱性条件下呈蓝色），被还原后红色消失还原型抗坏血酸还蓝色），被还原后红色消失还原型抗坏血酸还原原2，，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血二氯靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。
酸 在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准原标准2，，6-二氯靛酚的量与样品中所含维生素二氯靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比的量成正比52 （一）（一）二氯靛酚法（测定还原型抗坏血酸）二氯靛酚法（测定还原型抗坏血酸）原理图示原理图示还原型还原型抗坏血酸抗坏血酸还原型还原型2，，6-二二氯靛酚法氯靛酚法（无色）（无色）H H+ +2，，6-二氯靛二氯靛酚法（粉红色）酚法（粉红色）+脱氢型脱氢型抗坏血酸抗坏血酸+53 o2、试剂、试剂o⑴⑴ 1%草酸溶液：称取草酸溶液：称取10g草酸，加水至草酸，加水至1000ml；；o⑵⑵ 2%草酸溶液：称草酸溶液：称20g草酸，加水至草酸，加水至1000ml；；o⑶⑶ 维生素维生素C标准液：准确称标准液：准确称20mgVC溶于溶于1%草酸中，并稀释至草酸中，并稀释至100ml，，吸吸5ml于于50ml容量瓶中，加入容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此草酸至刻度，此溶液每毫升含有溶液每毫升含有0.02mgVC；；54 o ⑷⑷ 0.02%2，，6-二氯靛酚溶液：称二氯靛酚溶液：称取取2，，6-二氯靛酚二氯靛酚50mg，，溶于溶于200ml含有含有52mg碳酸氢钠的热水中，冷却碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至后，稀释至250ml，，过滤于棕色瓶中，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每星期贮存于冰箱内，应用过程中每星期标定一次。
标定一次55 o标定一：吸标液（标定一：吸标液（VC））5ml于三角瓶于三角瓶→加加6%KI溶液溶液0.5ml→加加1%淀粉淀粉3滴滴→用用0.001N KIO3标液滴定到淡兰色标液滴定到淡兰色o计算：计算： 抗坏血酸浓度（抗坏血酸浓度（mg/mL））= （（V1 × 0.088））/ V2oV1 - 滴定时消耗滴定时消耗0.001N KIO3标液的体积标液的体积（（mL））oV2 -维生素维生素C溶液的体积（溶液的体积（mL））o0.088 -1ml0.001N KIO3标液标液≈维生素维生素C的的量（量（mg/mL）） 56 o标定二：吸标定二：吸5ml已知浓度已知浓度V C标液标液 → 加加5ml1%草酸草酸 → 用染料用染料2，，6-二氯靛酚滴定二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在至溶液呈粉红色，在15秒不褪色为终点秒不褪色为终点o计算：每毫升计算：每毫升2，，6-二氯靛酚相当于维生二氯靛酚相当于维生素素C的毫克数等于滴定度（的毫克数等于滴定度（T））o T= （（C × V1））/ V2oC - 维生素维生素C的浓度（的浓度（mg/ml））oV1 -维生素维生素C的体积（的体积（ml））oV2 -消耗消耗2，，6-二氯靛酚的体积（二氯靛酚的体积（ml）） 57 o⑸⑸ 0.001N KIO3标液：吸标液：吸0.1N KIO3溶液溶液5ml→于于500ml容量瓶内容量瓶内→加水加水至刻度，每毫升相当于至刻度，每毫升相当于VC0.008mg；；o⑹⑹ 0.5%淀粉溶液；淀粉溶液；o⑺⑺ 6%KI溶液。
溶液58 o3、操作方法、操作方法o⑴⑴ 提取：称样提取：称样50g→加加2%草酸草酸100ml→到入捣碎机中到入捣碎机中→处理处理→过滤过滤→颜色若深可颜色若深可加白陶土，加白陶土，将上述溶液过滤，滤液备用将上述溶液过滤，滤液备用o⑵⑵ 滴定：吸滴定：吸5ml样液样液→于三角瓶于三角瓶→用染料用染料滴定至粉红色滴定至粉红色→15秒内不褪色秒内不褪色o计算：计算：VC（（mg/100g））=（（V × T））/ W × 100 oV -消耗染料体积（消耗染料体积（ml））oT -1ml染料所能氧化维生素染料所能氧化维生素C的毫克数的毫克数oW- 滴定时所有滤液中含有样品的克数滴定时所有滤液中含有样品的克数 59 注意事项注意事项⑴⑴ 所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；⑵⑵ 滴定时，可同时吸二个样品一个滴定，另一滴定时，可同时吸二个样品一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考；个作为观察颜色变化的参考；⑶⑶ 样品进入实验室后，应浸泡在已知量的样品进入实验室后，应浸泡在已知量的2%草酸草酸液中，以防氧化，损失维生素液中，以防氧化，损失维生素C；；⑸⑸ 整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化；被氧化；⑹⑹ 在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除；数滴辛醇消除；60 ⑷ ⑷ 贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低价铁贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低价铁离子（离子（FeFe2+2+），要用），要用8%8%的醋酸代替的醋酸代替2%2%草酸。
这时草酸这时如用草酸，低铁离子可以还原如用草酸，低铁离子可以还原2 2，，6-6-二氯靛酚，二氯靛酚，使测定数字增高，使用醋酸可以避免这种情况的使测定数字增高，使用醋酸可以避免这种情况的发生；发生；⑺ ⑺ 测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积除空白体积61 2、、2，，4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法P208 可测总抗坏血酸，总抗坏血酸包括还原型、可测总抗坏血酸，总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸型此法是将样品的还脱氢型和二酮古乐糖酸型此法是将样品的还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与2 2，，4-4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎脎的量二硝基苯肼作用，生成红色的脎脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总后进行比色，由标准曲线计算样品中总VCVC62 原理：原理：用用酸处理过的活性碳酸处理过的活性碳把还原型的抗坏血把还原型的抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，在继续氧化为二酮酸氧化为脱氢型抗坏血酸，在继续氧化为二酮古乐糖酸。
二酮古乐糖酸与古乐糖酸二酮古乐糖酸与2，，4-二硝基苯肼偶二硝基苯肼偶联生成红色的脎，其成色的强度与二酮古乐糖联生成红色的脎，其成色的强度与二酮古乐糖酸浓度呈正比，可以比色定量酸浓度呈正比，可以比色定量63 操作步骤操作步骤o（（1）样品的制备：称取适量样品（含）样品的制备：称取适量样品（含1-2mg抗坏血酸），鲜样加抗坏血酸），鲜样加1：：1量量2%草酸草酸溶液打成匀浆，干样加溶液打成匀浆，干样加1%草酸溶液磨成草酸溶液磨成匀浆，最后用匀浆，最后用1%草酸溶液定容至草酸溶液定容至100ml滤液备用滤液备用o（（2）氧化处理：取）氧化处理：取25ml滤液加入滤液加入0.5g活活性炭，振摇性炭，振摇1min，过滤，取，过滤，取10ml2%硫脲硫脲溶液，混匀备用溶液，混匀备用64 o（（3）呈色反应：取）呈色反应：取3支试管，每支试管都加入上支试管，每支试管都加入上述氧化稀释液述氧化稀释液4ml其中1支试管作空白管，另两支试管作空白管，另两支试管各加入支试管各加入10ml2%2，，4-二硝基苯肼溶液，二硝基苯肼溶液，将将3支试管放入（支试管放入（37+—0.5)度恒温箱中水浴度恒温箱中水浴3h。
取出试管放入冰水中空白管冷至室温后加入取出试管放入冰水中空白管冷至室温后加入0.1ml2%2，，4-二硝基苯肼溶液，二硝基苯肼溶液，10-15min后也放后也放入冰水中入冰水中 向每支试管中滴加向每支试管中滴加5ml85%的硫酸边加边摇动，滴的硫酸边加边摇动，滴加时间至少需要加时间至少需要1min，加完硫酸后将试管从冰水，加完硫酸后将试管从冰水中取出，室温下准确放置中取出，室温下准确放置30min后立即比色后立即比色65 o（（4）比色用空白液调零点，于）比色用空白液调零点，于500nm波长下测吸波长下测吸光值o（（5）标准曲线的绘制：加）标准曲线的绘制：加2g活性炭于活性炭于50ml标准溶标准溶液（液（1mg/ml)中，振摇中，振摇1min，过滤取滤液，过滤取滤液10ml于于500ml容量瓶中，加容量瓶中，加5.0g硫脲，用硫脲，用1%草酸溶液草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度为稀释至刻度，抗坏血酸浓度为20微克、毫升取微克、毫升取出溶液用出溶液用1%硫脲稀释成抗坏血酸依次为硫脲稀释成抗坏血酸依次为1、、2、、3、、4、、5、、8、、10和和12微克、毫升按样品测定步骤进微克、毫升。
按样品测定步骤进行显色反应并比色以吸光度为纵坐标，抗坏血酸行显色反应并比色以吸光度为纵坐标，抗坏血酸浓度为横坐标绘制标准曲线浓度为横坐标绘制标准曲线66 o(三三)荧光法荧光法oGB/T 5009.86—2003 第一法第一法o原理：样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化原理：样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化生成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺生成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（（OPDA)反应生成具有荧光的喹喔啉，其荧反应生成具有荧光的喹喔啉，其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量坏血酸的总量67 思考题：思考题：在用在用2、、6-二氯靛酚滴定法测定辣椒中二氯靛酚滴定法测定辣椒中Vc含量时含量时,假设滴定假设滴定20毫升标准毫升标准Vc溶液消耗染料溶液溶液消耗染料溶液8毫毫升升,而滴定而滴定15毫升样品溶液时毫升样品溶液时,消耗染料溶液消耗染料溶液14毫升毫升,试问试问:样品溶液中样品溶液中Vc的浓度的浓度? (标准标准Vc溶液溶液经经KIO3标定后计算得知其浓度为标定后计算得知其浓度为0.0192毫克毫克/毫升毫升)68 。
