獭兔成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因保守性研究.doc

獭兔成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因保守性研究摘要：本文主要通过选取约50只獭兔进行研究，主要通过对獭兔FGF5基因第4个外 显子基因片段约300bp的PCR产物直接测序，对獭兔毛皮性状的相关数据进行方差分析和 多重比较，并将獭兔CDS编码区序列同其他物种进行比对结果发现，在所选取的獭兔群 中，未发现碱基突变位点，在所有的个体中，仅发现了一种单倍体型；獭兔的主要毛皮性状 差异不显著(P>0.05)；獭兔CDS序列同其他物种相比差异不大表明FGF5-4基因片段在 所选取的獭兔种群中是相对保守的关键词：獭兔；FGF5-4基因；保守性獭兔，原名力克斯兔(Re rabbit),原产于法国，是珍贵的裘皮用兔，因 其皮毛酷似珍贵的毛皮兽一水獭，故被称之为獭兔⑴獭兔贵在毛皮，目前獭兔 毛皮被广泛用于服装业，制作成裘皮大衣、围巾等，具有良好的保暧作用，前 景十分广阔⑺成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor, FGF)广泛存在于各组织中， 迄今为止共鉴定出23种FGFs, FGF5是FGF家族中的一员⑶众多学者研究发 现，FGF5基因对兔的毛皮性状具有重要的调节作用，可以作为研究其毛皮性状 的遗传标记⑷。

木研究通过PCR方法扩增出獭兔FGF5基因的第4个外显子后，采用直接 测序的方法研究FGF5基因外显子4的保守性，分析所选獭兔群体的毛皮性状的 相关数据，并将獭兔的CDS序列同其他物种进行对比，以期为研究FGF5基因 与獭兔毛皮性状的相关性提供理论依据1材料和方法1. 1实验动物选择来自浙江省余姚市某獭兔场的獭兔共50只实验期结束后，采取颈静脉 取血的方式采血10 ml左右于抗凝管中，后于・20C保存1.2方法1.2. 1獭兔基因组DNA提取使用天根公司牛产的血液基因组DNA提取试剂盒提取獭兔血液基因组 DNA,并使用微量核酸仪检测所提取的DNA浓度,保证所提取的DNA浓度在 80ng/^tL 以上1.2.2引物设计使用Primcr5.0设计引物，扩增出兔FGF5基因外显子4的片段，片段长度为320bp左右引物由上海英骏生物技术有限公司合成引物序列见表1表1 PCR扩增所用引物序列、产物长度以及复性温度 产物长度~~复性温度Tm(C)F： 5・3 AGTTCAGGGAGCGATTTC 300bp 54R： 5・3 AGCGAAACTTGAGTCTGTAT 1.2. 3PCR 扩增PCR扩增总体积为50(iL,其中包括25|iL Premi Taq™> 21(iLddH20、上下 游引物各IgL (10 pmol / gL)、2|iL模板DNA。

PCR扩增程序：94C预变性5 min； 然后94C 45 S,复性温度54C, 72C1 min, 34个循环；最后72C继续延伸10 mine PCR产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，结束后用UVP荧光成像系统分析 检测扩增结果1.2.4产物纯化与测序将未纯化的PCR产物送上海生工生物技术有限公司进行纯化并测序1.2.5数据分析测序结果使用Clustal 排定DNA序列，再进行人工核对，并采用Bioedit, DNA man, DNA star•等软件进行序列结构分析以及序列峰图的校正等1.2.6獭兔毛皮性状的统计分析按照所选獭兔群体的体重不同分为4组，利用Ecel记录整理所得到的毛皮性 状的相关数据(主要包括体重、毛长、皮长、体宽等)用SPSS19.0统计分析软件进行单因子组内重复数等的方差分析，对差界显 著数据的组间进行LSD多重方法进行比较显著性分析结果均以平均值土标准 误表示2结果2. 1獭兔FGF5-4基因的扩增以獭兔基因组DNA为模板，通过自行设计的引物,在上述PCR反应条件下, 特异地扩增出FGF5第4个外显子的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳(图1), 扩增条带长度在300bp左右。

图1獭兔FGF5-4基因PCR扩增产物2.2獭兔FGF5-4基因片段序列分析及峰图分析PCR产物直接测序得到了 300bp左右的FGF5-4片段测序结果使用Bioedit 软件的Clustal 功能进行排定DNA序列，再进行人工核对测序所得的序列如 图2所示图3所示的为测序所得的峰图GGGCCAATGTACCTCACGTACTCAGCATACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTT 70 GAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATTTT 140 CTACCAAGATTCAAGCAGTCGGAGCAGCCAGAACTTTCCTTTACTGTTACTGTTCCTGAAAAGAAAAAGC 210 CGCCCAACCCTATCAAGCCAAAGGTTCCCCTTTCTGCACCTCGGAGAAGTCCCAACACAGTGAAATACAG 280 ACTCAAGTTTCGCTAGA 297图2獭兔FGF5-4基因测序序列170180 190200 210220 23340 50 60 TO 80 50 100 110 120 130 1400 ft Afi AfiAACA fifid CG G(1 ArtT GGTAT GT (； fiC CT T G AACAA AC (1 AG G G AAAfiCAAA GC GAfiftCT rtC ArtCCCAC fifi(1THAA ACC T CA GCACGT CT CTACCCAT T T T CTA(QAGAAQTCnCAACACA QT Q A A AT ACA G A C T C A图3獭兔FGF5-4基因测序峰图2. 3獭兔FGF5-4基因片段序列比对结果如图4所示为所测所有獭兔个体FGF5・4基因片段序列比对结果。

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATT， TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCaCGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATr TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATT ATACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCaCGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATTTACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGaACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCaCGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTAC：CATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAG^GG^ATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGaGGCTGCAGCCC.CGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTAC?CATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATT， TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGaACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCC^CGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTAC：CATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTAC：CATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATT ATACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCACGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTAC：CATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGTGGTATGTGGCCTTGAACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCaCGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAG^GG^ATGTGGCC^TG^ACAAACGAGGGAAAGCAAAGCGAGGCTGCAGCCCnCGGGTCAAACCTCAGCACGTCTCTACCCATT TACACAGAACGGAGAGAACAGGGCGGGAGT。