生物安全实验室操作技术规范课堂PPT.ppt

生物安全实验室操作技术规范生物安全实验室操作技术规范1发展概况和我国现状发展概况和我国现状•国际概况•20世纪50～60年代•1983年WHO第一版《实验室生物安全手册》（Laboratory Biosafety Manual）•1993年WHO发表了第二版《实验室生物安全手册》(Laboratory Biosafety Manual ，2nd edition) •2002年WHO又发表了《实验室生物安全手册》第二版的网络修订版•2004年正式发布了第三版 2•关于实验室生物安全规范化管理，美国、欧洲、加拿大等国家做得都比较好•在1993年由美国疾病预防控制中心/国立卫生研究院（CDC/NIH）发布了《Biosafety in the Microbiological and Biomedical Laboratories Manual,3th edition CDC/NIH》•1999年发布了第四版，目前已被国际公认为“金标准”3国内概况（1）：起步•进口少数BSL-3实验室•20世纪80年代我国自己研制第一个国产三级生物安全防护水平（biosafety level 3, BSL-3）实验室诞生•我国也建造了一批此种防护水平或接近BSL-3水平的生物安全实验室。

•2002年颁布了《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS 233－2002），这是一个开创性工作 •2003年《兽医实验室生物安全通用标准》并已颁布实施4国内概况（2）：SARSSARS期间期间•2003年5月6日科技部、卫生部、国家食品药品监督管理局和国家环境保护总局联合发布了关于印发《传染性非典型肺炎病毒研究实验室暂行管理办法》的通知其内容包括《传染性非典型肺炎病毒研究实验室暂行管理办法》和《传染性非典型肺炎病毒的毒种保存、使用和感染动物模型的暂行管理办法》5国内概况（国内概况（3 3）：国家标准）：国家标准•2003年8月开始起草，《实验室生物安全通用要求》GB19489-20042004年5月中华人民共和国质量监督检验检疫总局 和中华人民共和国标准化管理委员会正式颁布了该标准•2004年9月1日中华人民共和国建设部与国家质量监督检验检疫总局又联合发布了《生物安全实验室建设技术规范》(GB50346-2004）6国内概况（4） 《病原微生物实验室生物安全管理条例》《病原微生物实验室生物安全管理条例》•2004年11月12日，由温家宝总理签发中华人民共和国国务院令(第424号)公布施行《病原微生物实验室生物安全管理条例》（简称《条例》）。

该《条例》规定了在病原微生物实验活动中保护实验人员和公众健康的宗旨，从而使我国病原微生物实验室的管理工作步入法制化管理轨道不言而喻，《条例》对我国防生物威胁和处理突发卫生事件的建设具有现实的和深远的意义7临床检验相关生物危险等级分布临床检验相关生物危险等级分布0 02020404060608080100100120120140140160160180180200200病毒病毒细菌细菌真菌真菌寄生虫寄生虫一级一级二级二级三级三级四级四级8病原微生物实验室的有关概念病原微生物实验室的有关概念一、生物学相关概念一、生物学相关概念1. 生物因子（剂）(bio-agents): 具有一定生物活性的制剂2. 微生物（microbes, microorganisms）: 微生物是指活的生物因子，包括能够复制或基因物质传递的细胞或非细胞的微小生物实体，其中包括致病和非致病的微生物主要指细菌（螺旋体、立克次体、衣原体）、真菌、病毒和某些寄生虫3. 病原体（pathogens）: 病原体是能致病的生物因子，包括能够引发人和动物、植物传染病的生物因子，主要指致病微生物9生物学相关概念生物学相关概念•4、生物战剂、生物战剂 (agent of bio-war): •5、、生物气溶胶生物气溶胶 (bioaerosol) ：： 气溶胶是指悬浮于气体介气溶胶是指悬浮于气体介• 质中粒径一般为质中粒径一般为 0.001-100μm的固态或液态微小粒子的固态或液态微小粒子• 形成的相对稳定的分散体系。

形成的相对稳定的分散体系分散相含有生物因子的分散相含有生物因子的• 气溶胶气溶胶•6. 生物战剂气溶胶生物战剂气溶胶 (bio-agent aerosol)：：分散相含有生分散相含有生• 物战剂的气溶胶物战剂的气溶胶气溶胶喷洒是国外生物战释放生物战气溶胶喷洒是国外生物战释放生物战• 剂的主要方式剂的主要方式10生物学相关概念•7.生物危害 (bio-hazard)和生物危险 (bio-risk)：生物危害是由生物因子形成的伤害生物危险 (bio-risk)是生物因子将要或可能形成的危害，是伤害概率和严重性的综合•8.危险废物（hazardous waste）：即有潜在危险的废物，即可燃、易燃、腐蚀、有毒、传染、放射或其他破坏作用的废物 11病原微生物实验室的有关概念病原微生物实验室的有关概念二、生物威胁概念二、生物威胁概念•1．生物威胁 (bio-threat)：是指生物因子形成的使人忧虑的、可能发生的严重危害•2．生物战（bio-war）：是指用生物战剂进行的战争 •目前世界发达国家的生物武器相当先进，武器化能力很强；一些第三世界国家也掌握了生物武器，被称为穷人的原子弹；一旦发生造成的灾难不可设想国内外有关专家认为发生生物战的潜在危机正在增加，令人忧虑12病原微生物实验室的有关概念病原微生物实验室的有关概念二、生物威胁概念二、生物威胁概念•3．生物恐怖（bio-terror）：生物恐怖是遇到生物因子形成的危险和邪恶产生的极度恐惧。

生物恐怖的特点是具有想象或未来时间较长的忧虑或恐惧生物恐怖活动可利用的病原体种类很多、攻击面宽、实施手段多种多样、突然发生、真真假假难以预料和防护13二、生物威胁概念二、生物威胁概念•4．基因武器（gene weapon）： 指用基因工程研制的生物武器 现代生物技术的发展一方面为人类造福，另一方面也会被人利用发展武器现代生物技术能改变生物战剂的攻击性能，改变其抗原性使之难以诊断；增强其致病性以加强杀伤力；增强其存活力以延迟攻击时间和扩大攻击面积；增强其抗药性造成治疗困难；改变其基因特性形成基因武器专家推测，基因武器能够进行对人种的特异性攻击14二、生物威胁概念二、生物威胁概念•5．实验室相关感染 (laboratory-associated infection)：由于从事实验活动而发生的与操作的生物因子相关的感染在研究病原微生物中存在某种风险，如果在管理和操作病原体中一旦有所疏漏或错误就会发生实验室感染，造成威胁，进而可能造成病原体扩散或传染病的流行•6．医院感染 (hospital-acquired infection)：医院感染也叫医院获得性感染或院内感染, 指在医院内发生的一切感染。

15二、生物威胁概念二、生物威胁概念•7.人畜共患病 (zoonosis): 人和动物间相互传播的传染病人的传染病常常由动物传播, 可通过接触经皮肤和粘膜感染, 也可经消化道进入体内, 更可通过气溶胶经呼吸道感染 •8．外来病 (exotic disease)：国外存在和流行的，国内尚未证实存在或已被消灭的传染病•9．传染病 （communicable disease）: 是指由各病原体引起的一组具有传染性的疾病已有的一些烈性传染病还没有有效的预防和控制，已经控制的一些传染病有死灰复燃的势头，新的传染病不断出现，是我们面临挑战 16二、生物威胁概念二、生物威胁概念•10．突发公共卫生事件 (emergent events of health)：（简称突发事件），是指突然发生，造成或者可能造成社会公众健康严重损害的重大传染病疫情、群体性不明原因疾病、重大食物和职业中毒以及其他严重影响公众健康的事件突发公共卫生事件的危害性和破坏性是多方面的，不仅危害公众身体健康和生命安全、造成公众心理恐惧，甚至导致社会混乱、经济衰退，威胁国家安全17二、生物威胁概念二、生物威胁概念•11．食源性传染病 （food borne infectious ： 指通过饮食媒介经消化道感染的疾病。

 第53届世界卫生大会上，世界卫生组织将食品安全列为重要议题，并指出食源性疾病与食品污染是不断扩大的公共卫生问题在过去的20年里，食源性疾病的发生率明显上升在发达国家，估计每年有1／3以上的人群感染食源性疾病美国每年约有7000万～8000万人患食源性疾病，其中32.5万人入院治疗，5000人死亡18国内外病原微生物危害程度分类比较国内外病原微生物危害程度分类比较    《《病病原原微微生生物物实实验验室室生生物物安安全全管管理理条条例例》》按按危危害害程程度将病原微生物分为四类：度将病原微生物分为四类： 第四类危险程度最低，第四类危险程度最低， 第一类危险程度最高，第一类危险程度最高， 第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物生物 《实验室生物安全通用要求》（《实验室生物安全通用要求》（GB 19489-2004GB 19489-2004）对）对微生物的危害进行分类，评价标准和等级划分与微生物的危害进行分类，评价标准和等级划分与WHOWHO《生《生物安全手册》第三版（物安全手册》第三版（20042004）基本一致，）基本一致， 但危害程度由但危害程度由4 4级至级至1 1级递减级递减19国内外病原微生物危害程度分类比较国内外病原微生物危害程度分类比较不同标准微生物危害等级划分与标准不同标准微生物危害等级划分与标准 《病原微生物实验室生物安全管理条例》《实验室生物安全 通 用 要 求 》(GB19489-2004)WHO《生物安全手册》（第三版，2004）四四类类在在通通常常情情况况下下不不会会引引起起人人类类或或者者动动物物疾疾病病的微生物。

的微生物  ⅠⅠ级级（低个体危害，低群体危害）不会导致健康工作者和动物致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子ⅠⅠ级级（ 无或极低的个体和群体危险）不太可能引起人或动物致病的微生物  20国内外病原微生物危害程度分类比较国内外病原微生物危害程度分类比较三三类类能能够够引引起起人人类类或或者者动动物物疾疾病病，，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传传播播风风险险有有限限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具具备备有有效效治治疗疗和和预预防防措施的微生物  Ⅱ级 (中等个体危害，有限群体危害)能引起人或动物发病，但一般情况下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危害的病原微生物实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限 Ⅱ级（ 个体危险中等，群体危险低）病原微生物能够对人或动物致病，但对实验室工作人员、社区、牲畜或环境不易导致严重危害实验室暴露也许会引起严重感染，但对感染有有效的预防和治疗措施，并且疾病传播的危险有限管理条例管理条例通用要求通用要求 WHO WHO安全手册安全手册21国内外病原微生物危害程度分类比较国内外病原微生物危害程度分类比较 二二类类能够引起人类或者动物严重疾病，比比较较容容易易直直接接或或者者间间接接 在在 人人 与与 人人 、、动动物物与与人人、、动动物物与与动动物物间间传传播播的微生物。

Ⅲ级（高个体危害，低群体危害）能引起人类或动物严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗的病原微生物Ⅲ级（ 个体危险高，群体危险低）病原微生物通常能引起人或动物的严重疾病，但一般不会发生感染个体向其他个体的传播，并且对感染有有效的预防和治疗措施管理条例管理条例通用要求通用要求 WHO WHO安全手册安全手册22国内外病原微生物危害程度分类比较国内外病原微生物危害程度分类比较一一类类能够引起人类或者动物非常严严重重疾疾病病的微生物，以以及及我我国国尚尚未未发发现现或或者者已已经经宣宣布布消消灭的微生物灭的微生物  Ⅳ级(高个体危害，高群体危害)能引起人类或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容容易易直直接接或或间间接接或或因因偶偶然然接接触触在在人人与与人人，，或或动动物物与与人人，，或或人人与与动动物物，，或或动动物物与与动动物物间间传传播播的病原微生物Ⅳ级（个体和群体的危险均高）病原微生物通常能引起人或动物的严重疾病，并且很很容容易易发发生生个个体体之之间间的的直直接接或或间间接接传传播播，对感染一般没有有效的预防和治疗措施。

管理条例管理条例通用要求通用要求 WHO WHO安全手册安全手册23 我国对具体病原微生物的分类详见卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名录》该名录除对病原微生物的危害分类标准除进行危害程度分类外，还规定了其不同实验操作的防护水平以及运输的包装要求 24四、生物安全防护相关概念四、生物安全防护相关概念（（1 1））•1．生物安全防护 (bio-safety containment)：是指避免生物危险因子，特别是偶然的和有意利用的生物因子，对生物体包括实验室工作者在内的伤害和对环境的污染的意识和措施实验室生物安全防护分为•一级防护（屏障）(primary barriers)•二级防护（屏障）(secondary barriers)25四、生物安全防护相关概念（四、生物安全防护相关概念（2 2））•2．一级防护：包括两方面内容：（1）生物安全柜 (biological safety cabinet, BSC)和类似的设备等，分成三个级别；（2）个人防护装备 (personal protective equipment, PPE)，也分成三个级别•3. 二级防护: 是指实验室屏障设施，其建设有4 种不同的结构。

•各种一级防护和二级防护的组合构成不同防护水平级别的实验室（￿ BSL-1〜4）26四、生物安全防护相关概念（四、生物安全防护相关概念（3 3））•4.生物安全防护实验室 (biosafety containment for laboratories): 指能够避免或控制被操作的有害生物因子危险的实验室•措施：通过规范的实验室设计和精心施工、正确的实验设备的配置、适合的个人防护装备的使用、严格管理、翔实的操作规程（SOP) 实现其功能•建造具有BSL-1和BSL-2的实验室称为基础实验室；具有BSL-3防护水平的实验室被称为生物安全防护实验室；达到BSL-4水平的称为高度生物防护实验室27四、生物安全防护相关概念（四、生物安全防护相关概念（4 4））•5．生物安全柜 ( bio- safety cabinet , BSCs)：是直接操作危险性微生物时所用的箱形安全设备，是生物安全实验室必备的装备，保护使用者和环境，保护样品•按防护水平生物安全柜分为I级、II级、III级, II级的又分为4种类型 (Class IIA1、Class IIA2、Class IIB1和Class IIB2)。

28四、生物安全防护相关概念（四、生物安全防护相关概念（5 5））•6．安全罩 (safety hood)：即覆盖在生物医学实验室工作台或仪器设备上的内部空气压力低于环境压力的经HEPA滤器过滤的排风罩，以减少对实验室工作者和环境的危害 •7．围场操作（enclose）：是指操作有害生物因子时，用物理防护设备把病原微生物局限在一定的空间内，避免生物因子对人体的暴露和污染环境29四、生物安全防护相关概念（四、生物安全防护相关概念（6 6））•8．气锁（airlock）和缓冲间（buffer room）：气锁是设置在气压不同的邻近二区之间的气压可调节的密闭小室，作为二区的过渡通道•缓冲间 是设在生物安全实验室的清洁区与半污染区之间，或半污染区与污染区之间的类似于气锁的密闭小室，小室的两门互锁30四、生物安全防护相关概念（四、生物安全防护相关概念（7 7））•9．个人防护装备：用于防止人员受到化学和生物等有害因子伤害的器材和装备其根本目的是屏蔽生物因子,不与人体发生直接接触我国在传染病和微生物实验室把个人防护分为三级•10．实验室分区 (laboratory area)：我国把BSL-3和BSL-4实验室平面布局明确分为：“三区二缓”的结构。

三区”是指把实验室分成污染 (C)、潜在(半)污染 (B)、清洁 (A)三个功能区31四、生物安全防护相关概念（四、生物安全防护相关概念（8 8））•（1）清洁区：是指在正常情况下不可能有实验因子的污染的区域•（2）半污染区：是指在正常情况下只有轻微污染可能的区域此区的功能是大量的准备工作, 例如培养基、细胞、制剂的配制、低温冰箱的放置等在此工作的人员要做好个人防护, 如穿上一层防护服、戴口罩和手套等•（3）污染区：是指操作实验因子的地方 (BSL-3中心实验室), 在操作过程中一定会有污染的区域, 有潜在严重污染的可能32四、生物安全防护相关概念（四、生物安全防护相关概念（9 9））•（4）缓冲间：是指在A和B之间, B和C之间的区域（小室）缓冲间有送、排风进行净化换气, 以保证在人员出入时污染空气不会直接向清洁区扩散或分割到清洁区其功能包括空气隔离、更衣换鞋、去污染消毒淋浴•（5）传递窗：在BSL-3的A和B, B和C之间各设一个物流通道, 以便传递实验物资它也是2门连锁, 并可进行消毒33实验室生物安全实验室生物安全操作者操作者操作对象操作对象环境环境34• •所有操作人员必须经过培训，通过考核，所有操作人员必须经过培训，通过考核，获得上岗证书获得上岗证书；；• •在在开开始始相相关关工工作作之之前前，，应应对对所所从从事事的的病病原原微微生生物物及及相相关关操操作作进进行行危危险险评评估估，，根根据据国国家家对对于于各各种种微微生生物物操操作作的的危危险险等等级级划划分分和和防防护护要要求求以以及及危危险险评评估估的的结结果果，，制制定定全全面面、、细细致致的的标标准准操操作作规规程程和和程程序序文文件件，，对对于于关关键键的的危危险险步步骤骤设设计计出出可行的防护措施并对这些细节了然于胸；可行的防护措施并对这些细节了然于胸；• •熟熟悉悉各各级级生生物物安安全全实实验验室室运运行行的的一一般般规规则则，，掌掌握握各各种种仪仪器器、、设设备备、、装装备备的的操操作作步步骤骤和和要要点点，，对对于于各各种种可可能能的的危危害害应应非非常熟悉；常熟悉；• •应掌握各种感染性物质操作的一般准则和技术要点。

应掌握各种感染性物质操作的一般准则和技术要点生物安全意识至关重要生物安全意识至关重要35实验室感染的传播链实验室感染的传播链容器中的病原体容器中的病原体泄漏泄漏预防接种预防接种感染途径感染途径/ /感染剂量感染剂量传播传播个人防护装备个人防护装备易感宿主易感宿主规程规程/ /设备设备潜伏期潜伏期医学监测医学监测规程规程/ /设备设备36实验室的生物安全规范实验室的生物安全规范 •实验室的运行规范实验室的运行规范实验室的运行规范实验室的运行规范•仪器设备的使用规范仪器设备的使用规范仪器设备的使用规范仪器设备的使用规范•针对感染性材料的操作规范针对感染性材料的操作规范针对感染性材料的操作规范针对感染性材料的操作规范•个人防护用品的使用规范个人防护用品的使用规范个人防护用品的使用规范个人防护用品的使用规范 …… …… …… …… 37• Laboratory Biosafety Manual, 3rd edition - lab commissioning and certification - lab biosecurity conceptsBiosafety:To promote the use of safe practices in the handling of pathogenic microorganisms•in the laboratory •during transportation •in field investigations •in manufacturing facilities •in health-care facilitiesLaboratory Biosafety Manual1st edition1983199320032004WHO Laboratory Biosafety Manual- translated into F, S, P, Ch, Ru- available on web, CD-Rom, hard copies 38病原微生物实验室的生物危险病原微生物实验室的生物危险 39实验室主要生物危害实验室主要生物危害•微生物气溶胶吸入微生物气溶胶吸入微生物气溶胶吸入微生物气溶胶吸入•刺伤、割伤刺伤、割伤刺伤、割伤刺伤、割伤•皮肤、黏膜污染皮肤、黏膜污染皮肤、黏膜污染皮肤、黏膜污染•食入食入食入食入•感染的实验动物咬伤感染的实验动物咬伤感染的实验动物咬伤感染的实验动物咬伤 ……………………还有许多不明原因的实验室相关感染还有许多不明原因的实验室相关感染还有许多不明原因的实验室相关感染还有许多不明原因的实验室相关感染 40•PikePike等等等等对对对对3 3 921921例例例例实实实实验验验验室室室室相相相相关关关关感感感感染染染染统统统统计计计计分分分分析析析析结结结结果果果果发发发发现现现现，，，，已已已已知知知知原原原原因因因因的的的的实实实实验验验验室室室室感感感感染染染染只只只只占占占占全全全全部部部部感感感感染染染染的的的的1818％，不明原因的实验室感染却高达％，不明原因的实验室感染却高达％，不明原因的实验室感染却高达％，不明原因的实验室感染却高达8282％。

％•对对对对不不不不明明明明原原原原因因因因的的的的实实实实验验验验室室室室感感感感染染染染的的的的研研研研究究究究表表表表明明明明，，，，大大大大多多多多数数数数可可可可能能能能是是是是病病病病原原原原微微微微生生生生物物物物形形形形成成成成的的的的感感感感染染染染性性性性气气气气溶溶溶溶胶胶胶胶在在在在空空空空气气气气扩扩扩扩散散散散，，，，实实实实验验验验室室室室内内内内工工工工作作作作人人人人员员员员吸吸吸吸入入入入了了了了污污污污染染染染的的的的空空空空气气气气感感感感染发病的染发病的染发病的染发病的41实验室微生物气溶胶的种类实验室微生物气溶胶的种类•飞沫核气溶胶飞沫核气溶胶飞沫核气溶胶飞沫核气溶胶•粉尘气溶胶粉尘气溶胶粉尘气溶胶粉尘气溶胶 • • 两两两两类类类类微微微微生生生生物物物物气气气气溶溶溶溶胶胶胶胶对对对对实实实实验验验验室室室室工工工工作作作作人人人人员员员员都都都都具具具具有有有有严严严严重重重重的的的的危危危危害害害害性性性性，，，，其其其其程程程程度度度度取取取取决决决决于于于于微微微微生生生生物物物物本本本本身身身身的的的的毒毒毒毒力力力力、、、、气气气气溶溶溶溶胶胶胶胶的的的的浓浓浓浓度度度度、、、、气气气气溶胶粒子大小、以及当时实验室内的微小气候条件。

溶胶粒子大小、以及当时实验室内的微小气候条件溶胶粒子大小、以及当时实验室内的微小气候条件溶胶粒子大小、以及当时实验室内的微小气候条件• • 研研研研究究究究发发发发现现现现，，，，粒粒粒粒径径径径>100>100>100>100   m m m m的的的的飞飞飞飞沫沫沫沫沉沉沉沉降降降降很很很很快快快快，，，，而而而而粒粒粒粒径径径径<50<50<50<50   m m m m的的的的飞飞飞飞沫沫沫沫在在在在0.4s0.4s0.4s0.4s内内内内就就就就扩扩扩扩散散散散开开开开了了了了；；；；粒粒粒粒径径径径<5<5<5<5   m m m m的的的的飞飞飞飞沫沫沫沫核核核核被被被被人人人人吸吸吸吸入入入入后后后后，，，，可可可可以以以以到到到到达达达达肺肺肺肺深深深深部部部部的的的的肺肺肺肺泡泡泡泡处处处处；；；；粒粒粒粒径径径径>5>5>5>5   m m m m的的的的飞飞飞飞沫沫沫沫核核核核能能能能够够够够被被被被呼吸道的粘膜捕获呼吸道的粘膜捕获呼吸道的粘膜捕获呼吸道的粘膜捕获 42产生微生物气溶胶的其它因素产生微生物气溶胶的其它因素•另外，一些在自然环境中可以繁殖的微生物，一旦进入实验室的空调或通风系统，污染了空调的冷却水，则可以形成更广泛的微生物气溶胶污染。

•除了实验室操作可以产生微生物气溶胶外，患有呼吸道传染病或皮毛上染有病原微生物的实验动物也可以产生微生物气溶胶•微生物气溶胶在一个实验室内产生后，还可以通过气流转移到同一建筑物的其他地方，甚至污染整个建筑物的空气 43生物安全实验室的运行规范生物安全实验室的运行规范 44生物安全防护水平（生物安全防护水平（BSLBSL））         由一级防护屏障（安全设备）和二级防护由一级防护屏障（安全设备）和二级防护屏障（实验室设施）组合构成四级生物安全屏障（实验室设施）组合构成四级生物安全水平水平 •一级生物安全防护水平（一级生物安全防护水平（BSLBSL－－1 1））•二级生物安全防护水平（二级生物安全防护水平（BSLBSL－－2 2））•三级生物安全防护水平（三级生物安全防护水平（BSLBSL－－3 3））•四级生物安全防护水平（四级生物安全防护水平（BSLBSL－－4 4））45一级生物安全防护水平（一级生物安全防护水平（BSLBSL－－1 1））MBSL－1适合于已知其特征的、在健康成人中不引起疾病的、对实验室工作人员和环境危害性最小的生物因子（对应于我国的第四类危害的微生物）的工作。

M许多通常与人类疾病不相关的病原微生物是条件致病性的，在特定情况下，可以在儿童、老年人、免疫缺陷的和免疫抑制的个体中引起感染M对于在体内已经繁殖多代的疫苗株不要简单地认为是无毒的46一级生物安全防护水平（一级生物安全防护水平（BSLBSL－－1 1））M枯草杆菌、格氏阿米巴原虫和感染性犬肝炎病毒是符合这些标准微生物的代表MBSL－1不需要特殊的一级和二级屏障、除需要洗手池外，依靠标准的微生物操作即可获得基本的防护水平47BSLBSL－－1 1 实验室实验室48二级生物安全防护水平（二级生物安全防护水平（BSLBSL－－2 2））•二级生物安全防护水平是指实验室的操作、安全设备、和设施适用于操作我国的第三类（少量二类）危害的致病微生物二级生物安全防护水平是适合于从未知病原的人身上取血、体液和组织49二级生物安全防护水平（二级生物安全防护水平（BSLBSL－－2 2））•接触这些致病微生物的工作人员的主要危害是与感染性材料的偶然的皮肤或粘膜破损、或吞食感染性食物必须强调对污染的针头或利器的使用要非常谨慎对未知是通过气溶胶途径传播的微生物、具有可以增加工作人员暴露的可能气溶胶或高度飞溅物的程序，二级生物安全防护水平微生物操作必需在一级生物安全防护水平的基础之上，增加生物安全柜、高压灭菌器、安全离心机罩帽、防溅罩或面罩等。

50BSLBSL－－2 2实验室实验室51BSLBSL－－1 1实验室安全设备的要求实验室安全设备的要求•BSL－1实验室–对高压灭菌器、离心机安全罩没有要求；–生物安全柜要求Ⅰ型生物安全柜 52BSLBSL－－1 1实验室安全设备的要求实验室安全设备的要求M防护服M实验室外套 M手套53BSLBSL－－1 1实验室安全设备的要求实验室安全设备的要求M另另外外, ,个个人人防防护护设设备可能也需要备可能也需要M面部防护面部防护M眼睛防护眼睛防护54BSLBSL－－2 2实验室安全设备的要求实验室安全设备的要求•生物安全柜 各实验室根据实际情况选用合适的Ⅱ级A1型或B1型生物安全柜生物安全柜应安装在BSL－2实验室内气流流动小，人员走动少，离门和中央空调送风口较远的地方生物安全柜的周围应有一定的空间，与墙壁至少保持30cm的距离，便于清洁环境卫生 55BSLBSL－－2 2实验室安全设备的要求实验室安全设备的要求•高压灭菌器高压灭菌器 高压灭菌器应选择立式或台式不排气（产生的蒸汽被回收）的，放置在BSL－2实验室内，或门外•离心机安全罩离心机安全罩 不需要离心机安全罩。

•洗眼器洗眼器 应根据实验室的实验活动内容，确定是否需要安装洗眼器如果需要洗眼器，则应安装在BSL－2实验室内靠近出口的地方 56一、一、BSL-1和和BSL-2实验室实验室57（一）（一） BSL-1和和BSL-2实验室的进入实验室的进入• •未未经经批批准准，，任任何何人人不不得得进进入入实实验验室室工工作作区区域域儿儿童童不不得得进进入入实实验验室室工工作作区区域域可可能能增增加加获获得得性性感感染染的的危危险险性性或或感感染染后可能引起严重后果的人员不允许进入实验室或动物房后可能引起严重后果的人员不允许进入实验室或动物房• •BSL-2BSL-2实实验验室室门门上上应应标标有有国国际际通通用用的的生生物物危危害害警警告告标标志志，，包包括括通通用用的的生生物物危危险险性性标标志志，，标标明明传传染染因因子子、、实实验验室室负负责责人或其他人姓名、、以及进入实验室的特殊要求人或其他人姓名、、以及进入实验室的特殊要求• •实验室的门应保持关闭实验室的门应保持关闭• •工作人员进入动物房应当经过特别批准工作人员进入动物房应当经过特别批准• •与实验室工作无关的动物不得带入实验室。

与实验室工作无关的动物不得带入实验室58（二）（二） BSL-1和和BSL-2防护要求防护要求• •在实验室工作时，必须穿着合适的工作服或防护服在实验室工作时，必须穿着合适的工作服或防护服• •在在进进行行可可能能接接触触到到血血液液、、体体液液以以及及其其他他具具有有潜潜在在感感染染性性的的材材料料或或感感染染性性动动物物的的操操作作时时，，应应戴戴上上合合适适的的手手套套手手套套用用完完后后，，应应先先消消毒毒再再摘摘除除，，随后必须洗手随后必须洗手• •在在处处理理完完感感染染性性实实验验材材料料和和动动物物后后，，以以及及在在离离开开实实验验室室工工作作区区域域前前，，都必须洗手都必须洗手• •为为了了防防止止眼眼睛睛或或面面部部受受到到喷喷溅溅物物的的污污染染、、碰碰撞撞或或人人工工紫紫外外线线辐辐射射的的伤伤害，必须戴合适的安全眼镜、面罩（面具）或其他防护设备害，必须戴合适的安全眼镜、面罩（面具）或其他防护设备• •严禁穿着实验室防护服离开实验室工作区域严禁穿着实验室防护服离开实验室工作区域• •不得在实验室内穿露脚趾的鞋不得在实验室内穿露脚趾的鞋• •禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜。

禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜• •禁止在实验室工作区域储存食品和饮料禁止在实验室工作区域储存食品和饮料• •在实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内在实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内59（三）（三） BSL-1和和BSL-2有关操作的指导原则有关操作的指导原则•严禁用口吸移液管, 严禁将实验材料置于口内严禁舔标签•所有的实验操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行•应限制使用注射针头和注射器除了进行肠道外注射或抽取实验动物体液外，注射针头和注射器不能用于移液或用作其他用途•实验室应制订并执行处理溢出物的标准操作程序出现溢出、事故以及明显或可能暴露于感染性物质时，必须向实验室负责人报告实验室应如实记录有关暴露和处理的情况，保存相关记录•污染的液体在排放到生活污水管道以前必须清除污染（采用化学或物理学方法）根据所处理的微生物因子的危险度评估结果准备专门的污水处理系统•只有保证在实验室内没有受到污染的文件纸张才能带出实验室60（四）（四） BSL-1和和BSL-2实验室工作区的实验室工作区的管理原则管理原则•实验室应保持清洁整齐，严禁摆放和实验无关的物品。

•每天工作结束后应清除工作台面的污染若发生具有潜在危害性的材料溢出应立即清除污染•所有受到污染的材料、标本和培养物在废弃或清洁再利用之前，必须先清除污染•感染性材料的包装和运输应遵循国家和∕或国际的相关规定•如果窗户可以打开，则应安装防止节肢动物进入的纱窗61（五）（五） BSL-1和和BSL-2生物安全管理生物安全管理的指导原则的指导原则• •实实验验室室负负责责人人负负责责制制订订和和采采用用生生物物安安全全管管理理计计划划以以及及实实验验室室安安全全或或/ /和操作手册和操作手册• •实验室应能提供常规的实验室安全培训实验室应能提供常规的实验室安全培训, , 并建立制度并建立制度• •实实验验室室负负责责人人（（或或生生物物安安全全负负责责人人））要要将将生生物物安安全全实实验验室室的的特特殊殊危危害害告告知知实实验验室室人人员员，，同同时时要要求求他他们们阅阅读读生生物物安安全全或或/ /和和操操作作手手册册，，并并遵遵循循标标准准的的操操作作程程序序实实验验室室内内应应备备有有可可供供取取阅阅的的安安全全或或/ /或或操操作作手手册册所所有有实实验验室室人人员员必必须须经经过过培培训训，，了了解解所所从从事事工工作作的的危危险险、、掌掌握握有有关关的的管理规定和操作程序，通过考核后方可从事相关实验室工作。

管理规定和操作程序，通过考核后方可从事相关实验室工作• •应当制订节肢动物和啮齿动物的控制方案应当制订节肢动物和啮齿动物的控制方案• •如如有有必必要要，，应应为为所所有有实实验验室室人人员员提提供供适适宜宜的的医医学学评评估估、、监监测测和和治治疗疗，，并并建建立立健健康康档档案案实实验验室室人人员员应应接接受受与与所所操操作作生生物物因因子子或或实实验验室室内内潜潜在的因子相关的免疫接种或检测在的因子相关的免疫接种或检测62三级生物安全防护水平（三级生物安全防护水平（BSLBSL－－3 3））•三级生物安全防护水平是指实验室的操作、安全设备、和设施适用于操作我国第二类（个别第一类）病原微生物这些致病微生物对工作人员的主要危害是与自身接种(自伤)、吞服、和暴露于感染性气溶胶 63三级生物安全防护水平（三级生物安全防护水平（BSLBSL－－3 3））•三级生物安全防护水平有严格的一级防护屏障和二级防护屏障的要求，以防止相邻区域的工作人员、社会和环境暴露于可能的感染性气溶胶例如，所有实验室操作应该在生物安全柜或其它密闭容器中操作，诸如气密型气溶胶发生柜这一水平的二级屏障包括实验室的控制入口和为减小感染性气溶胶从实验室释放的特殊通风系统。

64BSLBSL－－3 3实验室实验室65BSLBSL－－3 3实验室安全设备的要求实验室安全设备的要求•生物安全柜生物安全柜 BSL－3实验室必须安装和使用生物安全柜，应根据病原微生物试验活动的内容的不同，选择不同型别的生物安全柜Ⅱ级A2型、B1型生物安全柜，B2型生物安全柜也可以使用，但因换气量太大，对实验室负压和气流的影响比较大，一般不需要使用Ⅱ级B2生物安全柜；少数特殊操作（如感染的中型和大型动物解剖）可以使用Ⅱ级B2生物安全柜另外，BSL－3实验室内安装Ⅱ级生物安全柜时，要充分考虑实验室和生物安全柜的气流平衡和回流的问题生物安全柜排风口与排风管道之间可以通过硬连接，也可以通过套管结构连接，无论是那一种连接方式，排风管道中都应有止回阀，且排风管道中还应有一道HEPA过滤器 66BSLBSL－－3 3安全设备安全设备( (一级屏障一级屏障) )M在在BSL-1 and 2安全设备的基础上，加安全设备的基础上，加:M呼吸道保护呼吸道保护67BSLBSL－－3 3实验室安全设备的要求实验室安全设备的要求•高压灭菌器高压灭菌器 在BSL－3实验室的半污染区和清洁区之间，宜安装双扉生物安全型高压灭菌器，即高压灭菌器跨墙安装，双门互锁结构，且对高压产生的蒸汽具有回收再高压的性能。

高压灭菌器的安装，必须确保高压灭菌器与墙体之间的密封，不能够有一点泄漏污染区内应设置不排蒸汽的高压蒸汽灭菌器或其他消毒装置 68BSLBSL－－3 3实验室安全设备的要求实验室安全设备的要求•离心机安全罩 是否需要离心机安全罩，取决于离心机的类型如果是传统型的离心机，最好安装离心机安全罩；如果离心机是新式生物安全型的，即负压离心机或有离心杯帽的离心机，则不需要离心机安全罩离心机和安全罩宜靠近排风口 69BSLBSL－－3 3实验室安全设备的要求实验室安全设备的要求•洗手装置洗手装置          应在污染区和半污染区出口处设洗手装置洗手装置的供水应为非手动开关供水管应安装防回流装置不得在实验室内安设地漏下水道应与建筑物的下水管线完全隔离，且有明显标识下水应直接通往独立的液体消毒系统集中收集，经有效消毒后处置 70四级生物安全防护水平（四级生物安全防护水平（BSLBSL－－4 4））•四级生物安全防护水平是指实验室的操作、安全设备、和设施适用于操作我国第一类病原微生物另外，与四级生物安全防护水平的微生物具有相近的或一致的抗原关系的微生物也应该在该防护水平进行研究 71四级生物安全防护水平（四级生物安全防护水平（BSLBSL－－4 4））•四级生物安全防护水平的微生物对工作人员的主要危害是呼吸道暴露于感染性气溶胶、粘膜暴露于感染性飞沫、和自身接种。

所有操作可能具有感染性的诊断材料、分离培养物、以及自然或实验感染的动物时，实验室工作人员、社会和环境均可造成高度危险的感染 72四级生物安全防护水平（四级生物安全防护水平（BSLBSL－－4 4））• III级生物安全柜或全身正压防护服能够把实验室工作人员与气溶胶的化感染性材料完全隔离开四级生物安全防护水平设施一般是独立建筑物或具有复杂的、特殊的通风系统和防止活的微生物释放到环境中的污物处理系统与其它建筑完全隔离 73BSLBSL－－4 4实验室安全设备的要求实验室安全设备的要求•生物安全柜生物安全柜–BSL－4实验室必须安装和使用生物安全柜，应根据病原微生物试验活动的内容的不同，可以选择Ⅱ级B型和Ⅲ级两种不同型别的生物安全柜–在正压防护服型BSL－4实验室内，可以选择Ⅱ级生物安全柜；在生物安全柜型BSL－4实验室中，选择Ⅲ级生物安全柜；在混合型BSL－4实验室中，应选择Ⅲ级生物安全柜 74BSLBSL－－4 4实验室安全设备的要求实验室安全设备的要求•高压灭菌器高压灭菌器 根据《实验室－生物安全通用要求》GB19489－2004的要求，应在半污染区和清洁区墙上、半污染区和污染区墙上设置不排蒸汽的双扉高压灭菌器和浸泡消毒渡槽或熏蒸消毒室或带有消毒装置的通风互锁传递窗，以便传递或消毒不能从更衣室携带进出的材料、物品和器材。

高压灭菌器的安装，必须确保高压灭菌器与墙体之间的密封，不能够有一点泄漏污染区和半污染区墙上设置不排蒸汽的双扉高压灭菌器应与Ⅲ级生物安全柜直接相连 75生物安全柜的使用生物安全柜的使用 76生物安全柜特征比较生物安全柜特征比较柜柜 子子类类 型型面速度面速度（英尺（英尺/分）分）气流方式气流方式应应 用用非挥发性化学毒非挥发性化学毒物物/放射性物质放射性物质挥发性化学毒挥发性化学毒物物/放射性物质放射性物质ⅠⅠ级级7575前前面面进进，，后后面面出出，，顶顶部部通过通过HEPAHEPA过滤器过滤器能能能能1 1ⅡⅡ级级A1A1型型757570%70%通通过过HEPAHEPA在在工工作作区区内内循循环环，，3030％％通通过过HEPAHEPA排出到实验室内排出到实验室内能（微量）能（微量）不能不能A2A2型型100100同同ⅡA,ⅡA,但但箱箱内内呈呈负负压压和和管道排气管道排气能能能（微量）能（微量）2 2B1B1型型10010030%30%通通过过HEPAHEPA在在工工作作区区内内循循环环，，7070％％通通过过HEPAHEPA和严格的管道排出和严格的管道排出能能能（微量）能（微量）2 2B2B2型型100100无无循循环环，，全全部部通通过过HEPAHEPA和严格的管道排出和严格的管道排出能能能（少量）能（少量）1.安装上要求有一特殊管道通到室外、有一道活性炭过滤器、防爆的发动机及其它电路组成。

Ⅰ级柜如果操作挥发性化学物，则不能将废气排到室内2.化学浓度不能超过最低爆炸浓度77生物安全柜的选择保护类型保护类型生物安全柜的选择生物安全柜的选择个体防护，针对危险度1～3 级微生物Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级生物安全柜个体防护，针对危险度4 级微生物，手套箱型实验室Ⅲ级生物安全柜个体防护，针对危险度4 级微生物，防护服型实验室Ⅰ级、Ⅱ级生物安全柜实验对象保护Ⅱ级生物安全柜，柜内气流是层流的Ⅲ级生物安全柜少量挥发性放射性核素∕化学品的防护Ⅱ级B1 型生物安全柜，外排风式Ⅱ级A2型生物安全柜挥发性放射性核素∕化学品的防护Ⅰ级、Ⅱ级B2 型、Ⅲ级生物安全柜78生物安全柜内感染性材料溢洒的处理生物安全柜内感染性材料溢洒的处理• •当当当当发发发发生生生生少少少少量量量量溢溢溢溢洒洒洒洒时时时时，，，，应应应应用用用用吸吸吸吸收收收收纸纸纸纸巾巾巾巾立立立立即即即即处处处处理理理理，，，，并并并并立立立立即即即即用用用用浸浸浸浸满满满满消消消消毒毒毒毒液液液液的的的的毛毛毛毛巾巾巾巾或或或或纱纱纱纱布布布布对对对对生生生生物物物物安安安安全全全全柜柜柜柜及及及及其其其其内内内内部部部部的的的的所所所所以以以以物物物物品品品品进进进进行行行行擦擦擦擦洗洗洗洗。

工工工工作作作作面面面面消消消消毒毒毒毒后后后后应应应应更更更更换换换换手手手手套套套套，，，，不不不不论论论论是是是是摘摘摘摘下下下下手手手手套套套套还还还还是更换手套都要洗手是更换手套都要洗手是更换手套都要洗手是更换手套都要洗手• •若若若若发发发发生生生生大大大大量量量量溢溢溢溢洒洒洒洒，，，，液液液液体体体体会会会会通通通通过过过过生生生生物物物物安安安安全全全全柜柜柜柜前前前前面面面面或或或或后后后后面面面面的的的的格格格格栅栅栅栅流流流流到到到到下下下下面面面面去去去去，，，，生生生生物物物物安安安安全全全全柜柜柜柜内内内内所所所所有有有有的的的的物物物物品品品品都都都都应应应应该该该该进进进进行行行行表表表表面面面面消消消消毒毒毒毒并并并并拿拿拿拿出出出出生生生生物物物物安安安安全全全全柜柜柜柜，，，，在在在在确确确确保保保保生生生生物物物物安安安安全全全全柜柜柜柜的的的的排排排排水水水水阀阀阀阀被被被被关关关关闭闭闭闭后后后后，，，，可可可可将将将将消消消消毒毒毒毒液液液液倒倒倒倒在在在在工工工工作作作作台台台台面面面面上上上上，，，，使使使使液液液液体体体体通通通通过过过过格格格格栅栅栅栅流流流流到到到到排排排排水水水水盘盘盘盘上上上上。

所所所所有有有有接接接接触触触触溢溢溢溢出出出出物物物物品品品品的的的的材材材材料料料料都都都都要要要要进进进进行行行行消消消消毒毒毒毒和和和和/ / / /或或或或高压灭菌处理高压灭菌处理高压灭菌处理高压灭菌处理79感染性物质感染性物质运输的包装系统感染性物质感染性物质运输的包装系统感染性及潜在感染性物质的运输应使用三层包装系统感染性及潜在感染性物质的运输应使用三层包装系统 内层容器内层容器 中层包装中层包装 外层包装外层包装- -将样品采用防水、防漏的内层容器包装并贴上指示内容物的将样品采用防水、防漏的内层容器包装并贴上指示内容物的标签后装入中层容器标签后装入中层容器- -内层容器和中层容器间应放置足量的吸水性材料，以便内层内层容器和中层容器间应放置足量的吸水性材料，以便内层容器打破或泄漏时能吸收溢出的所有液体容器打破或泄漏时能吸收溢出的所有液体 -然后将中层容器固定在硬质外层容器中以免中层容器在运输然后将中层容器固定在硬质外层容器中以免中层容器在运输过程中受到物理性损坏过程中受到物理性损坏 80细胞工程原理及技术细胞工程原理及技术2.14: 2.14: 前言前言2.21: 2.21: 细胞培养的基本条件细胞培养的基本条件2.28: 2.28: 细胞培养的基本技术细胞培养的基本技术(I)(I)3.07: 3.07: 细胞培养的基本技术细胞培养的基本技术(II)(II)3.14: 3.14: 培养细胞的生物学特征培养细胞的生物学特征3.21: 3.21: 特殊组织细胞的培养特殊组织细胞的培养3.28: 3.28: 干细胞工程干细胞工程4.04: 4.04: 组织工程组织工程4.11: 4.11: 胚胎工程胚胎工程4.18: 4.18: 克隆技术克隆技术4.25: 4.25: 生物安全实验技术生物安全实验技术5.9-5.30: 5.9-5.30: 实验实验1 1 万级净化细胞培养室操作规程万级净化细胞培养室操作规程 实验实验2 2　　K562K562细胞的培养、传代、冻存和复苏细胞的培养、传代、冻存和复苏6.6-6.23: 6.6-6.23: 实验实验1 Hela1 Hela细胞的培养、活力检测、生长曲线测定细胞的培养、活力检测、生长曲线测定 实验实验2 2 流式细胞仪分析细胞周期和凋亡细胞流式细胞仪分析细胞周期和凋亡细胞教材：李志勇教材：李志勇, ,细胞工程细胞工程, ,科学出版社科学出版社,2003.8,2003.8 安利国安利国, ,细胞工程细胞工程, ,科学出版社科学出版社,2005.1,2005.181《细胞工程原理与技术》实验计划《细胞工程原理与技术》实验计划实验班级：PB03008指导老师：魏海明　张征　葛葵葵　邬鹏实验室负责人：张征实验分组:59人分2大组进入万级净化细胞间，每大组29-30人，分30个小组，每小组2人，实验材料准备及实验操作以小组为单位。

万级净化细胞培养室管理规则实验1　K562细胞的培养、传代、复苏和冻存 1 K562细胞的培养与传代 2 K562细胞的冻存 3 冻存细胞的复苏 实验2 Hela细胞的培养实验3 台盼蓝染色检测细胞活力实验4 生长曲线测定实验5 流式细胞仪原理及细胞分析82谢谢 谢！谢！83。