免疫组化的基本步骤.docx

免疫组化步骤1.4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置 20%蔗糖溶液（4℃）中过夜蜡块制作切片，贴片0.01MKPBS 清洗 5min×3 后； 2.加入配好的 0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇 80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS 清洗 5min×3； 3.加入配好的 0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MKPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS 清洗 5min×3； 4.加入用血清稀释液（牛血清白蛋白 1.00g＋0.01MPBS 100ml＋叠氮纳 0.08g）稀释的一抗，4℃存放 24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS 洗 5min×3； 5.加入 0.01MKPBS 稀释的二抗，室温孵育 2h0.01MKPBS 洗 5min×3； 6.加入 ABC 复合物之类的抗体，室温孵育 2h，0.01MKPBS 洗 5min×3；蒸馏水迅速冲三次； 7.加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过 30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS 终止反应； 8.梯度酒精脱水之后，封片，拍照。

免疫组化主要步骤1.洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓 H2SO4 混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓 H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于 37°C 温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys 带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用2.包埋组织:先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态3.切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为 5m,如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于 40°C 温水中4.捞组织：当组织载玻片置于 40°C 温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下 1/3 或者下 1/2 一般每种组织捞 5-6 张，其中 2-3 张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入 37°C 温箱中烘干。

5.脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放 10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.6.抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入 3%H2O2 浸泡 10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉 H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮 3min（中火） ，一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来7.血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗 2 次，并将载玻片置于 PBS 中5min，洗 2 次，擦干组织周围的 PBS 液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入 37°C 温箱中半小时血清稀释 10 倍（900lPBS：100l血清封闭液） 8.加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加 PBS加完一抗后于 4°C 冰箱中保存过夜。

9.加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入 PBS 中洗 3 次，每次 5min，擦干组织周围的PBS 后加上二抗,然后置于 37°C 温箱中半小时10. 加 SABC:将片子从温箱中取出, 放入 PBS 中洗 3 次，每次 5min，擦干组织周围的 PBS后加上 SABC, 然后置于 37°C 温箱中半小时SABC 稀释 100 倍（990lPBS：10lSABC） 11. 加显色剂：将片子从温箱中取出, 放入 PBS 中洗 3 次，每次 5min，擦干组织周围的PBS 后加上显色剂 （显色剂的配置：在 1ml 水中加 1 滴显色剂 A，摇匀，然后加 1 滴显色剂 B，摇匀，再加 1 滴显色剂 C，摇匀） A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液12. 复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织 3-5min13. 脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入 70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯每个试剂中放置 2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。

14. 封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干 免疫组化操作步骤一. 免疫组化（ LP 法）操作步骤 ： 1． 切片常规脱蜡至水如需抗原修复，可在此步后进行 2. 缓冲液洗 3min/2 次 3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟 4. 缓冲液洗 5min/2 次 5. 滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色 （注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略 ） 6. 缓冲液洗 5min/2 次 7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时 （具体孵育时间和温度由试验者最终决定） 8. 缓冲液洗 5min/2 次 9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟 10 ．缓冲液洗 5min/2 次 11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。

（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中 ） 12 ．缓冲液洗 5min/2 次 13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟具体时间由染色深浅决定 ） 14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片 二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤 ：（ 1 ） 、石蜡切片脱蜡至水 （ 2 ） 、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性 （ 3 ） 、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行） （ 4 ） 、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜 （ 5 ） 、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次 （ 6 ） 、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。

（ 7 ） 、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次 （ 8 ） 、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟 （ 9 ） 、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次 （ 10 ） 、显色剂显色 3-15 分钟（ DAB 或 NBT/BCIP ） （ 11 ） 、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片 三. 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片 4-8um ，室温放置 30 分钟后，入 4 ℃丙酮固定 10 分钟，PBS 洗，5 分钟 x3，用过氧化氢孵育 5-10 分钟，消除内源性过氧化物酶的活性以下同石蜡切片免疫组化。