基因工程的下游技术重组蛋白的表达纯化和分析.ppt

基因工程的下游技术基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析重组蛋白的表达、纯化和分析 重组蛋白的表达重组蛋白的表达表达体系：表达体系：        表达载体表达载体                     原核原核        受体细胞受体细胞                     真核真核选择表达载体常用的关键元件：选择表达载体常用的关键元件：启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等如多聚如多聚His标签－标签－6×His，便于镍柱亲和层析纯，便于镍柱亲和层析纯化GST融合蛋白用融合蛋白用GST柱亲和层析）柱亲和层析）分泌信号分泌信号筛选标记筛选标记其它其它6×His 重组蛋白的纯化重组蛋白的纯化亲和层析亲和层析离子交换层析离子交换层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析……         本单元实验流程：本单元实验流程：细菌（细菌（pEF-GFPuv））        亲和层析亲和层析IPTG诱导诱导细菌总蛋白细菌总蛋白重组蛋白融合蛋白重组蛋白融合蛋白乳糖操纵子的特性乳糖操纵子的特性SDS-PAGE初步分析初步分析实验十实验十 重组重组DNA在大肠在大肠杆菌中的诱导表达杆菌中的诱导表达1实验目的实验目的2实验原理实验原理3材料与试剂材料与试剂4实验仪器实验仪器5操作步骤操作步骤6注意事项注意事项7实验安排实验安排8思考与讨论思考与讨论1实验目的实验目的Ø了了解解和和掌掌握握IPTG诱诱导导表表达达的的原原理理。

Ø了了解解降降解解物物阻阻遏遏的的现现象象及及其其机机理理2实验原理实验原理Ø操纵子是基因表达的协调单位通常由操纵子是基因表达的协调单位通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成序列（如启动子序列、操纵序列等）组成Ø乳乳糖糖操操纵纵子子由由三三个个结结构构基基因因Z、、Y、、A和和操操纵纵序序列列、、启启动动子子、、CAP结结合合位位点点等等调调节节序序列组成Ø 乳糖操纵子的诱导表达乳糖操纵子的诱导表达l当当没没有有乳乳糖糖存存在在时时，，调调节节基基因因lacI表表达达，，转转录录的的mRNA翻翻译译成成阻阻遏遏蛋蛋白白阻阻遏遏蛋蛋白白与与操操纵纵序序列列lacO结结合合，，阻阻碍碍了了结结合合在在旁旁边边启启动动子子的的RNA聚聚合合酶酶向向前前移移动动，，使使结结构构基基因因不不能能转转录录，，也也就就不不能能翻翻译译出出蛋蛋白白质质也也就就是是说说，，当当没没有有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态Ø 乳糖操纵子的诱导表达（续）乳糖操纵子的诱导表达（续）l当当有有乳乳糖糖存存在在时时，，乳乳糖糖转转化化为为异异乳乳糖糖，，异异乳乳糖糖作作为为诱诱导导物物与与阻阻遏遏蛋蛋白白结结合合，，使使阻阻遏遏蛋蛋白白的的构构象象发发生生改改变变，，而而不不能能结结合合到到操操纵纵序序列列上上，，RNA聚聚合合酶酶可可以以从从启启动动子子向向3’端端移移动动，，于于是是，，结结构构基基因因可可以以转转录录出出mRNA，，然然后后翻翻译译出出蛋蛋白白质质。

也也就就是是说说，，当当有有乳乳糖糖存存在在时时，，乳乳糖糖操操纵子被诱导纵子被诱导l 乳乳糖糖操操纵纵子子的的诱诱导导物物是是异异乳乳糖糖IPTG是是异异乳乳糖糖的的结结构构类类似似物物由由于于IPTG不不会会被被分分解解，，它的诱导作用是持久的它的诱导作用是持久的Ø 乳糖操纵子的诱导表达（续）乳糖操纵子的诱导表达（续）l本本实实验验所所使使用用的的表表达达载载体体上上含含有有乳乳糖糖操操纵纵子子的的调调节节序序列列，，目目的的基基因因为为绿绿色色荧荧光光蛋蛋白白基基因因在在IPTG的的诱诱导导下下，，目目的的基基因因表表达达可可增增强强105倍倍然然而而，，诱诱导导表表达达常常常常受受到到温温度度和和诱诱导导物物的的影影响Ø乳糖操纵子的降解物乳糖操纵子的降解物阻遏阻遏l当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖只有当葡萄糖耗尽后，细菌才能充分利用乳只有当葡萄糖耗尽后，细菌才能充分利用乳糖，这种现象称葡萄糖效应，其实质是由葡糖，这种现象称葡萄糖效应，其实质是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又称降解萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又称降解物阻遏（物阻遏（catabolic repression）。

Ø乳糖操纵子的降解物乳糖操纵子的降解物阻遏（续）阻遏（续）l降解物降解物阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白（（Catabolite gene Activation Protein，，CAP），又称），又称cAMP受体蛋白（受体蛋白（cAMP Receptor Protein，，CRP）属于激活蛋白的一）属于激活蛋白的一种，对乳糖操纵子进行正调节种，对乳糖操纵子进行正调节    CAP分分子子内内分分别别有有DNA结结合合区区和和cAMP结结合合区区当当CAP与与cAMP结结合合后后，，就就可可结结合合到到CAP结合位点上，促进转录结合位点上，促进转录    葡葡萄萄糖糖降降解解物物能能抑抑制制腺腺苷苷酸酸环环化化酶酶的的活活性性，，并并活活化化磷磷酸酸二二酯酯酶酶的的活活性性，，从从而而降降低低cAMP的浓度，抑制转录的浓度，抑制转录Ø 阻遏蛋白负调节与阻遏蛋白负调节与CAP正调节的协调正调节的协调   当当阻阻遏遏蛋蛋白白封封闭闭转转录录时时，，CAP对对该该系系统统不不能能发发挥挥作作用用；；而而没没有有CAP存存在在时时，，即即使使没没有有阻阻遏遏蛋蛋白白与与操操纵纵序序列列结结合合，，操操纵纵子子仍仍无无转转录录活活性性。

只只有有在在CAP存存在在且且没没有有阻阻遏遏蛋蛋白白与与操操纵纵序序列列结结合合时时，，或或者者说说只只有有高高乳乳糖糖低低葡葡萄萄糖糖时时，，操操纵子发挥最大转录活性纵子发挥最大转录活性   这种协调与细菌对碳源的优先利用相一致这种协调与细菌对碳源的优先利用相一致The structure of lac operon调节序列调节序列结构基因结构基因Repressor and negative regulation异乳糖异乳糖异丙基硫代半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷异乳糖异乳糖CAP and positive regulation 低乳糖时低乳糖时 高乳糖时高乳糖时在协调调节下，在协调调节下，lac operon的强诱导作用发生在高乳糖、的强诱导作用发生在高乳糖、低葡萄糖的状态低葡萄糖的状态3材料与试剂材料与试剂1.材料材料        含含pUC18质粒工程菌及含质粒工程菌及含pGFPuv质粒工质粒工程菌2.试剂试剂①①LB 液体培养基液体培养基 ：：        蛋蛋白白胨胨（（tryptone））10g、、酵酵母母粉粉（（yeast extract））5g、、NaCl  10g，，加加800mL双双蒸蒸水水溶溶解解，，用用10M NaOH调调pH至至7.2-7.5，，定容至定容至1000mL。

          分装，高压灭菌，分装，高压灭菌，4℃保存②②氨苄青霉素溶液：氨苄青霉素溶液：      无无菌菌双双蒸蒸水水配配成成100mg/mL，，分分装装，，-20℃保保存，使用终浓度为存，使用终浓度为50μg/mL或或100μg/mL③③IPTG溶液：溶液：      将将 238.3mg  IPTG溶溶 解解 于于 10mL双双 蒸蒸 水水 ，，0.22μm细细菌菌滤滤器器过过滤滤除除菌菌，，分分装装，，-20℃保保存备用，贮存浓度为存备用，贮存浓度为100 mM④④20%葡萄糖溶液：葡萄糖溶液：       20g葡葡萄萄糖糖溶溶解解于于适适量量双双蒸蒸水水，，定定容容至至100mL，，121℃，，15min 灭菌，灭菌，4℃保存4实验仪器实验仪器 超净工作台、超净工作台、 恒温摇床、离心机等恒温摇床、离心机等5操作步骤操作步骤1.挑取含挑取含pUC18质粒工程菌及含质粒工程菌及含pGFPuv质质粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉（终浓度为（终浓度为100μg/mL，，以下同以下同)的的5mL的的LB培养基中，于培养基中，于37℃、、250rpm过夜培养过夜培养12h-14h至对数生长期。

至对数生长期2.取取3支支已已灭灭菌菌的的大大试试管管，，分分别别加加入入5mL含含有有氨氨苄苄青青霉霉素素的的LB培培养养液液，，编编号号为为1#，，2#，，3#，，另另取取一一个个250mL的的灭灭菌菌三三角角瓶瓶，，编编号号为为6#，，加加入入50mL含含氨氨苄苄青青霉霉素素的的LB培养液3.1#：接：接50μL空载工程菌（含空载工程菌（含pUC18））过夜培过夜培养物，养物，25-28℃培养培养10 h-12h；；     2#：：接接50μL重重组组菌菌（（含含pGFPuv））过过夜夜培培养养物，物，25-28℃培养培养10 h-12h；；     3#：：接接50μL重重组组菌菌（（含含pGFPuv ））过过夜夜培培养养物物，，37℃培培养养至至O.D600约约为为0.5（（约约3h-4h)，，然然后后加加入入20%葡葡萄萄糖糖50μL至至终终浓浓度度为为0.2%，，及及100mM IPTG 5μL至至终终浓浓度度为为0.1mM，，25-28℃培养培养8h-10h或过夜；或过夜；     6#：：接接500μL重重组组菌菌（（含含pGFPuv））过过夜夜培培养养物物，，37℃培培养养至至O.D600约约为为0.5（（约约3h-4h)，，然然后后只只加加入入100mM IPTG 50μL至至终终浓浓度度为为0.1 mM，，25-28℃培养培养8h-10h或过夜或过夜。

4. 收集菌体分别将收集菌体分别将1#-3#全部培养物收集到全部培养物收集到三个三个7mL离心管中，编上相应编号，离心弃上离心管中，编上相应编号，离心弃上清；三角瓶培养的清；三角瓶培养的50mL菌液混匀后取菌液混匀后取5mL于于7mL离心管中（编号为离心管中（编号为4#），离心，上清收集），离心，上清收集到另一个指管，编号为到另一个指管，编号为5#，其余的培养液用，其余的培养液用 50mL离心管于离心管于5000rpm，，4℃，离心，离心10min，，弃上清，菌体用裂解缓冲液重悬后用超声波破弃上清，菌体用裂解缓冲液重悬后用超声波破碎细胞或保存于－碎细胞或保存于－20℃备用（见实验十二）备用（见实验十二）    5. 于紫外灯下观察于紫外灯下观察1# -5#管收集的菌体或上清管收集的菌体或上清液，观察哪支管有荧光，记录观察到的现象液，观察哪支管有荧光，记录观察到的现象注意：把注意：把1#和和2#管置管置4℃保存分别标保存分别标Sample1和和Sample2 1＃＃2＃＃3＃＃6＃＃pUC18pGFPuv挑取单菌落，接种于挑取单菌落，接种于5mLLBA培养基中培养基中37℃过夜培养。

过夜培养按按1:100接种接种对照对照IPTG+GlcIPTG1＃＃2＃＃3＃＃6＃＃1＃＃2＃＃3＃＃4＃＃5＃＃25 ℃℃ -28℃培养过夜培养过夜5000rpm离离心心，，收菌体收菌体取取5mL离心离心其余离心收其余离心收菌体，提取菌体，提取蛋白蛋白6注意事项注意事项1.本实验的目的是比较该重组本实验的目的是比较该重组DNA在大肠在大肠杆菌中表达时受杆菌中表达时受IPTG和葡萄糖存在的影和葡萄糖存在的影响在转管培养及收菌时要注意各管编响在转管培养及收菌时要注意各管编号要相应对好，不能混乱号要相应对好，不能混乱        1#、、2#管不加管不加IPTG和葡萄糖和葡萄糖3#管除加管除加IPTG外还加入葡萄糖（浓度要大于外还加入葡萄糖（浓度要大于0.2%以上） 6#瓶仅加瓶仅加IPTG 2.不不同同的的重重组组DNA在在不不同同的的宿宿主主菌菌中中蛋蛋白白的的表表达达量量往往往往受受到到IPTG浓浓度度和和培培养养温温度度的的影影响响在在科科研研中中一一般般都都采采用用不不同同温温度度或或不不同同浓浓度度的的IPTG来来诱诱导导，，以以获获得得最最大大的的蛋蛋白白表表达量。

达量3.本本实实验验所所表表达达的的绿绿色色荧荧光光蛋蛋白白基基因因，，其其产产物物在在大大肠肠杆杆菌菌中中有有很很强强的的荧荧光光离离心心后后收收集集的的菌菌体体在在紫紫外外线线的的照照射射下下可可见见黄黄绿绿色色荧荧光光，，所所以以把把1#、、2#、、3#、、4#沉沉淀淀菌菌体体放放在在紫紫外外灯灯下下观观察察其其是是否否有有荧荧光光以以及及荧荧光光的的强强弱弱，，就就可可判判断断其其是是否否有有表表达达及及其其所所表表达达的的强度7实验安排实验安排         第一天：第一天：         上午配试剂，灭菌；上午配试剂，灭菌；         下午开始接种，约下午开始接种，约3 h-4h后开始诱导后开始诱导步骤（步骤2、、3））         第二天：第二天：         收菌、紫外观察结果和拍照；收菌、紫外观察结果和拍照；         破碎细菌，分离上清，待过柱破碎细菌，分离上清，待过柱8思考与讨论思考与讨论1.对紫外灯下观察到的结果作出解释对紫外灯下观察到的结果作出解释2.为什么诱导表达的大肠杆菌要在其为什么诱导表达的大肠杆菌要在其OD600浓度约为浓度约为0.5时加入时加入IPTG？？3.大肠杆菌的诱导表达常受哪些因素的影大肠杆菌的诱导表达常受哪些因素的影响？响？实验十二实验十二 金属鳌合亲和金属鳌合亲和层析分离目的蛋白质层析分离目的蛋白质 1实验目的实验目的2实验原理实验原理3材料与试剂材料与试剂4实验仪器实验仪器5操作步骤操作步骤6注意事项注意事项7实验安排实验安排8思考与讨论思考与讨论一．实验目的一．实验目的Ø学习亲和层析的原理。

学习亲和层析的原理Ø掌掌握握亲亲和和层层析析法法分分离离蛋蛋白白质质的的技技术术与与操作2实验原理实验原理Ø以普通凝胶作以普通凝胶作载载体，体，连连接上金属离子制成螯接上金属离子制成螯合吸附合吸附剂剂，用于分离，用于分离纯纯化蛋白化蛋白质质，，这这种方法种方法称称为为金属螯合金属螯合亲亲和和层层析Ø蛋白蛋白质对质对金属离子具有金属离子具有亲亲和力是和力是这这种方法的种方法的理理论论依据已知蛋白依据已知蛋白质质中的中的组组氨酸和半胱氨氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与酸残基在接近中性的水溶液中能与镍镍或或铜铜离离子形成比子形成比较稳较稳定的定的络络合物，因此，合物，因此，连连接上接上镍镍或或铜铜离子的离子的载载体凝胶可以体凝胶可以选择选择性地吸附含咪性地吸附含咪唑唑基和基和巯巯基的基的肽肽和蛋白和蛋白质质Ø过过渡渡金金属属元元素素镍镍在在较较低低pH范范围围时时（（pH 6-8）），，有有利利于于选选择择性性地地吸吸附附带带咪咪唑唑基基和和巯巯基基的的肽肽和和蛋蛋白白质质在在碱碱性性pH时时吸吸附附更更有有效效，，但选择性降低但选择性降低Ø金金属属螯螯合合亲亲和和层层析析在在很很大大程程度度上上，，由由被被吸吸附附的的肽肽和和蛋蛋白白质质分分子子表表面面咪咪唑唑基基和和巯巯基基的的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。

稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要Ø用用IPTG诱诱导导表表达达的的蛋蛋白白质质含含有有特特定定的的组组氨氨酸酸标标签签，，这这种种可可溶溶性性蛋蛋白白质质能能用用金金属属亲亲和和层层析析法法进进行行分分离离，，且且操操作作简简单单，，快快速速，，纯纯化效率高化效率高3材料与试剂材料与试剂1.材料材料        含含pUC18质粒工程菌及含重组质粒工程菌及含重组pGFPuv质粒质粒工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白2.试剂试剂①①0.05mol/L EDTA-0.5mol/L NaCl溶液溶液 50mL②②2mol/L NaCl 溶液溶液          50mL③③1mol/L NaOH溶液溶液         50mL④④0.2mol/L NiSO4溶液溶液       30mL⑤⑤起始缓冲液：起始缓冲液：50mmol/L Tris-HCl; 500mmol/L NaCl;   pH7.0  500mL⑥⑥Chelating Sepharose Fast Flow   4-5 mL⑦⑦大肠杆菌细胞裂解蛋白样品大肠杆菌细胞裂解蛋白样品  10-20mL⑧⑧洗涤液：洗涤液：50mmol/L咪唑；咪唑；50mmol/L Tris-HCl；； 0.5mol/L NaCl，，pH 7.0⑨⑨洗脱液：洗脱液：300mmol/L咪唑；咪唑；50mmol/L Tris-HCl；；0.5mol/L NaCl，，pH7.0        4实验仪器实验仪器              1.5cm X 50cm层析柱、自动分部收集层析柱、自动分部收集器、紫外分光光度计、紫外检测仪及器、紫外分光光度计、紫外检测仪及记录仪等。

记录仪等5操作步骤操作步骤1.样品的制备样品的制备:               细胞的培养及荧光蛋白表达见实验十，细胞的培养及荧光蛋白表达见实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下：细胞的破碎及蛋白的收集如下：        收集在收集在25℃培养的细胞培养液，培养的细胞培养液，5000r/min，，离心离心10min，，去上清液，菌体用起始缓冲去上清液，菌体用起始缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积（（细胞培养液）体积（15mL）的起始缓冲）的起始缓冲液充分悬浮，冰浴下进行超声波处理，功率液充分悬浮，冰浴下进行超声波处理，功率为为400W，，工作工作4秒，间隙秒，间隙4 秒，为一次，秒，为一次，99次为一周期共处理六周期然后次为一周期共处理六周期然后8000r/min,离心离心30min，，取上清液放冰箱取上清液放冰箱备用2.亲和层析柱的安装亲和层析柱的安装          把把层层析析柱柱固固定定在在铁铁支支架架上上，，柱柱下下端端出出口口封封闭闭加加入入少少量量的的无无离离子子水水，，排排去去下下端端的的空空气气泡泡取取出出20%乙乙醇醇浸浸泡泡的的螯螯合合凝凝胶胶4mL到到烧烧杯杯中中，，加加入入少少量量的的无无离离子子水水制制成成糊糊状状，，沿沿着着贴贴紧紧柱柱内内壁壁的的玻玻璃璃棒棒把把糊糊状状凝凝胶胶倒倒进进柱柱内内，，打打开开下下端端的的排排水水口口，，让让亲亲和和凝凝胶胶剂剂随随水水流流自自然然沉沉下下。

亲亲和和层层析析剂剂为为4-5mL3.亲和凝胶的再生处理：亲和凝胶的再生处理：①①用用10 倍柱体积的再生溶液（倍柱体积的再生溶液（0.05mol/L EDTA、、        0.5mol/L NaCl））过柱，流速过柱，流速3mL/min1drops/2s!②②用用5倍柱体积的倍柱体积的2 mol/L NaCl 溶液洗亲和层析柱除溶液洗亲和层析柱除去多余的去多余的EDTA流速3mL/min③③用用5倍柱体积的倍柱体积的1 mol/L NaOH溶液洗涤层析柱，流溶液洗涤层析柱，流速速2mL/min④④用用10倍柱体积的无离子水洗至倍柱体积的无离子水洗至pH8-9，，流速流速3mL/min⑤⑤用用2倍柱体积的倍柱体积的0.2mol/L的硫酸镍溶液过层析柱，使的硫酸镍溶液过层析柱，使凝胶金属镍离子结合凝胶金属镍离子结合, 流速流速2mL/min过完后放置过完后放置5 分钟⑥⑥用用10倍柱体积的无离子水洗涤层析柱除去多余的镍倍柱体积的无离子水洗涤层析柱除去多余的镍离子流速离子流速3mL/min⑦⑦用用5 倍柱体积的起始缓冲溶液平衡层析柱，备用倍柱体积的起始缓冲溶液平衡层析柱，备用4. 上样：上样：    先先从从15mL裂裂解解上上清清液液中中取取出出50µL准准备备用用于于电电泳泳，，作作为为亲亲和和层层析析分分离离前前上上清清液液中中的的总总蛋蛋区区带带对对照照图图谱谱（（Sample3））。

然然后后以以每每分分钟钟1mL的的流流速速上上层层析析柱柱，，分分部部收收集集流流出出液液，，每每管管3mL，，（（测测得得的的OD280值值曲曲线线为为穿穿流流峰峰，，取取最最高高的的一一管管样样品品液液用用作作电电泳泳，，标标Sample4））再再用用10mL起起始缓冲液过层析柱，操作同前始缓冲液过层析柱，操作同前5.  洗涤：洗涤：    用用含含50 mmol/L咪咪唑唑的的洗洗涤涤缓缓冲冲液液25mL洗洗脱脱，，分分部部收收集集洗洗脱脱液液，，每每管管5mL，，取取中中间间管管样样品品电电泳（泳（Sample5）） 6.  洗脱：洗脱：    用用含含300mmol/L咪咪唑唑的的洗洗脱脱缓缓冲冲液液10mL洗洗脱脱，，用用Ep管管分分部部收收集集洗洗脱脱液液每每管管收收0.5mL测测得得的的OD280值值曲曲线线峰峰为为目目的的蛋蛋白白峰峰GFP，，标标Sample6 ）7.  12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：进进行行12% SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳检检测测亲亲和和层层析析 分分 离离 纯纯 化化 的的 结结 果果 Sample1-6，， 外外 加加Marker（见实验十一）。

见实验十一）         6注意事项注意事项1.不管是装柱还是上样、洗脱，在整个操作过不管是装柱还是上样、洗脱，在整个操作过程中，水或溶液面都不能低于凝胶柱平面程中，水或溶液面都不能低于凝胶柱平面否则，凝胶柱会产生气泡，就会影响层析效否则，凝胶柱会产生气泡，就会影响层析效果2.样样品上柱和洗脱过程，其流速都要慢，分离品上柱和洗脱过程，其流速都要慢，分离效果才好效果才好3.亲和层析剂可回收，经再生可循环使用该亲和层析剂可回收，经再生可循环使用该亲和层析剂用亲和层析剂用20%20%乙醇浸泡于冰箱保存乙醇浸泡于冰箱保存4.亲和层析柱在再生处理、上样、洗脱过程中亲和层析柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色都有明显变化（白、蓝、绿），只要其颜色都有明显变化（白、蓝、绿），只要细心操作，样品是否被吸附上去或被洗脱下细心操作，样品是否被吸附上去或被洗脱下来？都能观察到从而作出判断来？都能观察到从而作出判断7实验安排实验安排 先用母液配制其它未配制溶液，再生先用母液配制其它未配制溶液，再生镍柱；然后，过柱纯化重组蛋白镍柱；然后，过柱纯化重组蛋白        8思考与讨论思考与讨论1.解释解释IPTG诱导表达的荧光蛋白经诱导表达的荧光蛋白经12％％ SDS-PAGE电泳结果图谱。

电泳结果图谱2.镍柱在再生处理、上样、洗脱过程镍柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色有何变化？为什么？中其颜色有何变化？为什么？3.要达到好的分离效果要注意哪些问要达到好的分离效果要注意哪些问题？题？实验十一实验十一  SDS-PAGE电泳分离电泳分离蛋白质蛋白质1实验目的实验目的2实验原理实验原理3材料与试剂材料与试剂4实验仪器实验仪器5操作步骤操作步骤6注意事项注意事项7实验安排实验安排8思考与讨论思考与讨论一一.实验目的实验目的 1.了了解解SDS-PAGE灵灵敏敏度度高高，，分分辩辩率率强强的的原理2.用用此此法法分分析析不不同同条条件件下下培培养养的的菌菌其其荧荧光光蛋白表达情况蛋白表达情况 2实验原理实验原理Ø聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳是是以以聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶作作为为支支持持介介质质的的一一种种电电泳泳方方法法聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶是是由由丙丙烯烯酰酰胺胺单单体体（（acrylamide,简简称称ACR））和和交交联联剂剂甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺（（N,N’-methylene bisacrylsmide 简简称称BIS））在在催催化化剂剂的的作作用用下下聚聚合合交交联联而而成成的的三三维维网网状状结结构构的的凝凝胶胶，，通通过过改改变变单单体体浓浓度度与与交交联联剂剂的的比比例例可可以得到不同孔径的凝胶。

以得到不同孔径的凝胶Ø聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶聚聚合合的的催催化化体体系系有有两两种种：：（（1））化化学学聚聚合合：：催催化化剂剂采采用用过过硫硫酸酸铵铵，，加加速速剂剂为为N、、N、、N’、、N’—四四甲甲基基乙乙二二胺胺（（简简称称TEMED））通通常常控控制制这这两两种种溶溶液液的的用用量量使使聚聚合合在在1h内内完完成成2））光光聚聚合合：：通通常常用用核核黄黄素素为为催催化化剂剂，，通通过过控控制制光光照照时时间间和和强强度度来来控控制制聚聚合合时时间间也也可可加加速速反反应应本本实实验验采采用用化化学学聚聚合合聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝电电泳泳常常分分为为二二大大类类：：第第一一类类为为连连续续的的凝凝胶胶（（仅仅有有分分离离胶胶））电电泳泳；；第第二二类类为为不不连连续续的的凝凝胶胶（（浓浓缩缩胶胶和和分分离离胶胶））电泳Ø通通常常聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶（（不不连连续续））电电泳泳有有三三种种效效应应：：①①电电荷荷效效应应；；（（电电泳泳物物所所带带电电荷荷的的差差异异性性））  ②②凝凝胶胶的的分分子子筛筛效效应应凝凝胶胶的的网网状状结结构构及及电电泳泳物物的的大大小小形形状状不不同同所所致致））③③浓浓缩缩效效应应，，（（凝凝胶胶浓浓度度的的不不连连续续性性、、缓缓冲冲液液离离子子成成分分的的不不连连续续性性、、电电位位梯梯度度的的不不连连续续性性以以及及pH的的不不连连续续性性所所致致））。

因因此此，，样样品品分分离离效效果好，分辨率高果好，分辨率高ØSDS-PAGE，，是是在在聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶系系统统中中引引进进SDS（（十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠））SDS破破坏坏蛋蛋白白质质的的二二级级和和三三级级结结构构；；强强还还原原剂剂使使半半胱胱氨氨酸酸之之间间的的二二硫硫键键断断裂裂，，因因此此，，蛋蛋白白质质在在一一定定浓浓度度的的含含有有强强还还原原剂剂的的SDS溶溶液液中中，，与与SDS分分子子按按比比例例结结合合，，形形成成带带负负电电荷荷的的SDS-蛋蛋白白质质复复合合物物这这种种复复合合物物由由于于结结合合大大量量的的SDS，，降降低低或或消消除除了了各各种种蛋蛋白白质质分分子子之之间间天天然然的的电电荷荷差差异异而而由由于于SDS与与蛋蛋白白质质的的结结合合是是按按大大小小成成比比例例的的，，在在进进行行电电泳泳时时，，蛋蛋白白质质分分子子的的迁迁移移速速度度取取决决于于分分子子大大小小当当分分子子量量在在15KD到到200KD之之间间时时，，蛋蛋白白质质的的迁迁移移率率和和分分子子量量的的对对数数呈呈线线性性关关系系，，符符合合下下式式：：logMW=K-bX，，式式中中：：MW为分子量，为分子量，X为迁移率，为迁移率，k、、b均为常数。

均为常数3试剂试剂①①30%的凝胶贮备液的凝胶贮备液:    Acr 29g + Bis 1g溶溶于于100mL去去离离子子水水中中避避光贮存棕色瓶中光贮存棕色瓶中②②3M Tris-HCl (pH8.9):    36.6g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至至100mL③③5×Tris-甘氨酸电泳甘氨酸电泳buffer（（pH8.3):  Tris-base15.1g + 甘甘氨氨酸酸94g + 5gSDS + H2O至至1L（（用时稀释用时稀释5倍） ④④10%SDS：：10g SDS溶溶解解于于100mL去去离离子子水水中中，，贮存于室温中贮存于室温中⑤⑤0.5M Tris-HCl(pH6.8):  6.05g  Tris-base  +  48mL  1M  HCl  +  dH2O至至100mL⑥⑥TEMED(四四甲甲基基乙乙二二胺胺):浓浓度度10%，，20 mL (共用共用)⑦⑦10% AP(过过硫硫酸酸铵铵):10 mL，，1g AP溶溶解解于于10mL去离子水中，新鲜配制去离子水中，新鲜配制 ⑧⑧ 2x样品缓冲液样品缓冲液：：                             100mM Tris-HCl(pH6.8)                             200mM DTT(二硫苏糖醇二硫苏糖醇)                             4% SDS                             0.2% 溴酚蓝溴酚蓝                             20% 甘油甘油⑨⑨ 考考马马斯斯亮亮蓝蓝染染色色液液：：0.25g考考马马斯斯亮亮蓝蓝R250溶溶于于45mL甲甲醇醇中中，，加加10mL冰冰醋醋酸酸  +  H2O至至100mL。

滤纸过滤除去不溶物）滤纸过滤除去不溶物）⑩⑩ 脱脱色色液液：：75mL冰冰乙乙酸酸 + 50mL甲甲醇醇 + 875mL H2O（如只配（如只配500mL，各物质减半），各物质减半）4实验仪器实验仪器 电电泳泳仪仪、、垂垂直直板板电电泳泳装装置置、、微微量量进进样器（样器（5050μLμL））、染色、染色/ /脱色摇床等脱色摇床等5操作步骤操作步骤1.胶板模型的安装：在干净的带隔板的玻璃板胶板模型的安装：在干净的带隔板的玻璃板的三条边上把橡胶条压上，然后将另一块凹的三条边上把橡胶条压上，然后将另一块凹形玻璃板压上，放入电泳槽中示范）形玻璃板压上，放入电泳槽中示范）2.12%分离胶的制备（每次配分离胶的制备（每次配10 mL））             去离子水去离子水                               3.2mL             30% 凝胶液凝胶液                          4.0mL             3mol/L Tris-HCl(pH8.9)      2.6mL                           10% SDS                               0.1mL             10% APS                               0.1mL             TEMED                                 0.005mL  用用手手轻轻摇摇约约2分分钟钟混混匀匀(注注意意不不要要产产生生气气泡泡））,小小心心将将混混合合液液注注入入准准备备好好的的玻玻璃璃板板间间隙隙中中，，为为浓浓缩缩胶胶留留足足够够的的空空间间，，轻轻轻轻在在顶顶层层加加入入几几毫毫升升去去离离子子水水复复盖盖，，以以阻阻止止空空气气中中氧氧对对凝凝合合的的抑抑制制作作用用。

刚刚加加入入水水时时可可看看出出水水与与胶胶液液之之间间有有界界面面，，后后渐渐渐渐消消失失，，不不久久又又出出现现界界面面，，这这表表明明凝凝胶胶已已聚聚合合再再静静置置片片刻刻使使聚聚合合完全   ！！注注意意：：为为避避免免凝凝胶胶过过快快聚聚合合，，配配胶胶用用的的无无离离子子水水、、30%的的凝凝胶胶液液及及Tris-HCl缓缓冲冲液液应应事先于事先于4℃或冰上放置或冰上放置,以下同3.浓浓缩缩胶胶的的制制备备：：先先吸吸去去已已聚聚合合好好的的分分离离胶胶上上层层的的水水，，用用水水洗洗界界面面一一次次，，再再用用滤滤纸纸吸吸干干残残留留的的水水液液按按下下列列配配方方制制备备5毫毫升升浓浓缩缩胶胶溶溶液液混混合合后后将将其其注注入入分分离离胶胶上上端端，，插插入入梳梳子子应应小小心避免气泡心避免气泡              去离子水去离子水                                3.2mL                                               30% 凝胶液凝胶液                           0.83mL                 0.5M Tris-HCl(pH6.8)          0.75mL              10% SDS                                0.050mL              10% AP                                  0.050mL              TEMED                                  0.005mL4.在在浓浓缩缩胶胶聚聚合合的的同同时时，，将将样样品品与与5×样样品品缓缓冲冲液液（（16μL＋＋ 4μL））混混合合，，100℃加加热热3分分钟钟以以变变性性蛋蛋白白质质。

Sample1,2用用600μL起起始始缓缓冲冲液液悬浮，取悬浮，取16μL同上操作同上操作5.浓浓缩缩胶胶聚聚合合完完全全后后，，小小心心地地拔拔出出梳梳子子，，用用无无离离子子水水冲冲洗洗梳梳孔孔，，将将凝凝胶胶模模板板放放入入电电泳泳槽槽上上固固定定好好，，上上下下槽槽均均加加入入1X电电泳泳缓缓冲冲液液，，检检查查有有无无漏漏液液，，除除去去两两玻玻璃璃板板间间凝凝胶胶底底部部的的气气泡泡，，上样前用上槽缓冲液冲洗梳子孔上样前用上槽缓冲液冲洗梳子孔6.按按次次序序上上样样：：用用微微量量进进样样器器往往凝凝胶胶梳梳孔孔中中加加样样品品混混合合液液，，20μL/孔孔，，一一孔孔加加一一个个样样品品，，同同时安排已知分子量的标准物作对照时安排已知分子量的标准物作对照7.电电泳泳：：开开始始时时浓浓缩缩胶胶电电压压为为80V，，染染料料进进入入分分离离胶胶后后，，将将电电压压增增到到120V，，继继续续电电泳泳至至染染料（溴酚蓝）到分离胶底部，断开电源料（溴酚蓝）到分离胶底部，断开电源8．．固固定定及及染染色色：：取取下下凝凝胶胶放放入入大大培培养养皿皿，，用用考考马马斯斯蓝蓝染染色色液液固固定定并并染染色色 ，，最最好好放放在在摇摇床床缓缓慢转动慢转动30min 。

9．．脱脱色色：：先先用用水水洗洗去去染染料料，，再再放放入入脱脱色色液液ⅠⅠ中中浸浸泡泡，，更更换换1-2次次，，至至条条带带清清晰晰，，背背景景呈呈淡淡蓝蓝色色，，然然后后换换脱脱色色液液ⅡⅡ，，至至背背景景清清晰晰，， 约约4h-8h10．．将将脱脱色色后后凝凝胶胶中中的的蛋蛋白白质质分分离离色色带带照照相相或或干干燥燥也也可可无无限限期期地地用用塑塑料料袋袋封封闭闭在在含含20%甘甘油的水中油的水中 1 2 3 4 5 1 1：细菌总蛋白（含：细菌总蛋白（含pBSKpBSK）；）；2 2：未经诱导细菌总蛋白（含：未经诱导细菌总蛋白（含pGFPuvpGFPuv）；）；3 3：经诱导细菌总蛋白（含：经诱导细菌总蛋白（含pGFPuvpGFPuv）；）；4 4：穿流峰：穿流峰流出液；流出液；5 5：纯化的：纯化的GFPuvGFPuv 1 2 3 4 5 6 7 1 1：：MarkerMarker；；2 2：细菌总蛋白（含：细菌总蛋白（含pUC18pUC18）；）；3 3：未经诱导细菌总蛋：未经诱导细菌总蛋白（含白（含pGFPuvpGFPuv）；）；4 4：经诱导细菌总蛋白（含：经诱导细菌总蛋白（含pGFPuvpGFPuv）。

Marker L1 L2 L3 L4 L5 L6 L1：细菌总蛋白（含：细菌总蛋白（含pUC18））sample1；；L2：未经诱导细菌总蛋白：未经诱导细菌总蛋白（含（含pGFPuv）） sample2；；L3：经诱导细菌总蛋白（含：经诱导细菌总蛋白（含pGFPuv））sample3 ；；L4：穿流峰流出液：穿流峰流出液sample4 ；；L5：： 50mmol/L咪唑洗脱液咪唑洗脱液sample5；；L6：：纯化的纯化的GFPuv sample6提交电泳图：提交电泳图：6注意事项注意事项1.制制备备聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶时时，，如如果果倒倒胶胶后后出出现现漏漏胶胶液液现现象象，，常常常常是是因因为为二二块块玻玻璃璃板板与与塑塑料料条条之之间间没没夹夹紧紧，，留留有有空空隙隙，，所所以以这这一一步步要要特特别别留心操作留心操作2.点点样样总总量量一一般般不不超超过过20μL，，如如果果点点样样量量太太多多而而溢溢出出梳梳孔孔，，就就会会污污染染旁旁边边泳泳道道要要根根据据样样品品浓浓度度来来加加样样。

每每点点一一个个样样品品后后换换一一支支吸吸头头或清洗吸头后再点另一个样品或清洗吸头后再点另一个样品3.电电泳泳完完毕毕取取凝凝胶胶时时要要小小心心细细致致，，不不能能用用死死力力弄坏玻璃板（尤其是凹形板）弄坏玻璃板（尤其是凹形板）4.固固定定及及染染色色：：考考马马斯斯亮亮蓝蓝染染色色液液盖盖过过凝凝胶胶即即可，染色后染色液要回收，可重复使用多次可，染色后染色液要回收，可重复使用多次7实验安排实验安排        SDS-PAGE，观察结果并拍照观察结果并拍照8思考与讨论思考与讨论1.在在不不连连续续体体系系SDS-PAGE中中,当当分分离离胶胶加加完后完后,需在其上加一层水需在其上加一层水,为什么为什么?2.电极缓冲液中甘氨酸的作用电极缓冲液中甘氨酸的作用?3.在在不不连连续续体体系系SDS-PAGE中中,分分离离胶胶与与浓浓缩胶中均含有缩胶中均含有TEMED和和AP,试述其作用试述其作用?4.样样品品液液为为何何在在加加样样前前需需在在沸沸水水中中加加热热几几分钟分钟?。