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临床医学流式细胞术研究(共6417字)摘要：流式细胞术是能在分子水平上对细胞内外因子进行快速定性和定量研究的一种细胞分析和检测的手段，是当代最先进的细胞定量分析技术是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机技术等学科高度发展的结晶其具有测量指标多、采集数量大、可高速分析上万个细胞，而且可同时检测一个样本中的多个被测因子，可进行多参数测量等优点近年来流式细胞术的发展取得了显著的成果，其应用领域和使用范围也在不断扩大本文对流式细胞术的工作原理和流式细胞仪的结构进行了简单的概述，并对其在血液学、免疫学、肿瘤学、细菌学、中医学等方面进行了综述关键词：流式细胞术；临床医学；应用近年来，随着单克隆抗体的应用及流式细胞术的快速发展，流式细胞术（ＦＣＭ）已成为许多疾病诊断和分性的重要依据流式细胞术是２０世纪７０年展起来的一项高新技术，它作为一门生物检测技术集计算机技术、测量技术、激光技术、流体动力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，是对快速直线运动状态中的细胞、生物颗粒或液体中的大分子物质进行多参数的、快速的定量分析和分选的一种技术［１］１９７３年美国ＢＤ公司推出全国第一台流式细胞仪，通过对流动液体中排列成单列细胞或颗粒进行逐个检测得到该细胞或颗粒的光散射和荧光指标，分析它们的体积、内部结构、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白质、抗原等物理及化学性质，还能对所需要的细胞进行分选等。

具有检测速度快、测量指标多、采集数量大，对所需的细胞或生物颗粒进行分析或分选等特点［２］，其在生物学、临床医学、遗传免疫学、肿瘤学等众多研究领域得到广泛应用１流式细胞仪的结构及工作原理１．１流式细胞仪的结构主要由五部分组成：（１）流动室及液流驱动系统；（２）激光光源及光束形成系统；（３）光学系统；（４）信号检测与储存、显示、分析系统；（５）细胞分选系统１．２流式细胞仪的工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的硫酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样鞘液就能够包绕样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包绕下单行排列，依次通过检测区域流式细胞仪通常以激光作为光源，经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光，这两种信号同时被前向光电二极管和９０°方向的光电倍增管接收，光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号，这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模／数转换器将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，计算机系统将这些数字信号收集、储存，以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来，可以用不同的标记物进行双参数、三参数甚至多参数的分析［３，４］。

２流式细胞仪的技术指标包括：（１）分析速度：很高可以达到５０００个／ｓ左右，大型的流式细胞仪的分析速度可达１００００个／ｓ；（２）荧光检测灵敏度：单个细胞上的荧光分子＜６００个，或两个细胞之间的荧光差＞５％就能区分；（３）前向角散射光检测灵敏度：一般的可以检测到的最小颗粒直径在０．２～０．５μｍ；（４）分辨率（ＣＶ）：一般流式细胞仪能够达到＜２．０％；（５）分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞１００个／ｓ，分选细胞纯度可达９９％［５］３流式细胞术在临床中的应用３．１在血液学中的应用流式细胞术通过对外周血细胞和骨髓细胞表面抗原和ＤＮＡ的检测分析对各种血液病如白血病、淋巴瘤等血液系统疾病的分型、诊断、治疗及预后判断均有重要作用血细胞在白细胞系、红细胞系、巨核细胞系、血小板及非造血细胞均有不同的分化抗原表达，分布在细胞质、细胞膜中血液肿瘤细胞的特征是丧失了正常细胞的系类专一性和分化阶段的规律性，运用流式细胞术将具有系列特异性并涵盖不同分化阶段的单克隆体作为分子探针来检测血液肿瘤细胞的内外抗原，可以反映其本质上与正常造血细胞的差异［６］流式细胞术采用各种抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体，借助于各种荧光染料（异硫氰基荧光素ＦＩＴＣ，藻红蛋白ＰＥ等）测定一个细胞的多种参数，以正确判断出该细胞的属性。

流式细胞术还可以应用在白血病免疫分型方面，目前国内外均主张采用ＦＣＭＣＤ４５／ＳＳＣ双参数散点图设计方法进行白血病免疫分析采用此法可将骨髓细胞清晰地分成淋巴细胞、单核细胞、成熟粒细胞、幼稚细胞和有核红细胞群，这样可以排除正常细胞对免疫分型的干扰，从而提高免疫分析的准确性，而且测量细胞一般在１～５万个细胞，快速特异、准确性好，并且能够提供正常细胞在演变成恶性肿瘤过程细胞基因及抗原标志发生变化的信息而这种细胞的变化是常规ＦＡＢ法所不能分辨的这种分型对于治疗方案的正确选择与预后有着重要的意义同时也提供了可靠的依据［７］近年研究发现，在临床血液病检测和诊断中诊断准确率高达９０％以上，与普通检测法相比准确率提高达２０％［８］流式细胞术可以通过某些荧光染料与红细胞中的ＲＮＡ结合，定量地测定网织红细胞中的ＲＮＡ，得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比，从而准确地反映骨髓造血功能有作者报道ＦＣＭ方法比目测法结果精确度更高［９］此外ＦＣＭ还可以测出网织红细胞的成熟度，对红细胞增值能力的判断很有意义，为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤患者放化疗对骨髓的抑制状况等提供依据３．２在肿瘤学中的应用流式细胞术在肿瘤学中的应用主要是对肿瘤细胞ＤＮＡ含量进行测定，包括癌前病变及早期癌变的检出，辅助肿瘤的早期诊断和鉴别诊断。

不仅如此，还可以根据化疗过程中肿瘤ＤＮＡ分布直方图的变化评估疗效，了解细胞动力学的变化临床医生可根据各细胞周期各时相的分布情况，结合化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳治疗方案，再依照ＤＮＡ直方图直接地看到肿瘤细胞的杀伤变化，及时调整治疗方案，选取有效药物以使对肿瘤细胞达到最大的杀伤效果［１０］３．３在免疫学中的应用利用抗原抗体特异性反应的原理将流式细胞仪与单克隆抗体结合，对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，广泛应用于临床，对人体细胞免疫功能的评估具有重要的意义流式细胞术可进行Ｔ、Ｂ和ＮＫ淋巴细胞水平的分析，还可以进行淋巴细胞亚群的分析，区分不同的淋巴细胞亚群，计算其相互间的比例，进而了解淋巴细胞的分化功能更重要的是，通过研究大多数疾病的特异性淋巴细胞亚群，对一些疾病如免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等的诊断、治疗、免疫功能的重建具有重要的指导意义例如ＣＤ４是辅助性淋巴细胞，它是迟发性超敏反应的启动者，是促使Ｂ淋巴细胞产生抗体的辅助性细胞，也是抑制性Ｔ细胞的诱导细胞，而ＣＤ８是抑制性Ｔ细胞，是细胞毒性Ｔ细胞介导反应的效应细胞，是抑制Ｂ细胞产生抗体的抑制性细胞［１１］。

在许多免疫性疾病中，淋巴细胞亚群的增多与减少对疾病的发展具有重要的作用如在先天性发育不良综合征中ＦＣＭ分析显示外周血ＣＤ３ＴＣＤ４＋和ＣＤ８＋Ｔ细胞均减少，在残余Ｔ细胞中Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）αβ分子表达减少，γδ分子表达正常，ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ细胞比例升高，随着受累者年龄的增加ＣＤ８＋细胞数增多，而有些患者Ｔ细胞数量增加，最终可达正常［１２］流式细胞术还可以进行ＨＬＡ群体分析，在强直性脊柱炎患者中用流式细胞术检测ＨＬＡ－Ｂ２７抗原阳性率高达９２．６％，而且可以排除交叉反应，提高检测的灵敏度和准确性［１３］３．４在中医药研究方面的应用流式细胞术可用于单味中药有效成分的作用效果测定分析如研究复方苦参方剂对大肠癌ＬｏＶｏ细胞体外增值凋亡的影响中，分析ＤＮＡ含量及细胞周期，结果显示Ｌｏ－Ｖｏ细胞可检测亚Ｇ１峰，凋亡率于对照组相对比例增高，细胞周期分析发现Ｓ期阻滞现象，表明复方苦参方剂具有一定的抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用［１４］在慢性阻塞性肺疾病的肺气虚证、肺阴虚证患者中ＣＤ４＋、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋均降低，ＣＤ８＋升高，说明肺气虚证与肺阴虚证患者均存在细胞免疫功能低下［１５］３．５在细菌学中的应用流式细胞术具有快速、灵敏、精确并能进行多参数分析的特点，可广泛应用于细菌的诊断和药敏实验，是研究细菌异质性、细菌抗生素后效应、多种病原菌混合感染等的有效方法。

常用的为流式细胞术药敏试验：检测不同细菌时，根据药物对细菌的作用机理选择合适的荧光染料，通过细菌总体平均荧光强度束反映抗生素对细菌的抗菌活性，３ｈ左右即可得出检测结果，尤其适用于急需药敏报告的重症感染病菌的检测３．６在血小板疾病诊断中的作用血小板是止血机制中一个重要因素，其表面含有多种糖蛋白及各种受体，这些受体与相应的配体相结合后，血小板被激活，并发生形态变化，血小板聚集和颗粒释放等一系列反应利用流式细胞术检测血小板标志物在许多血小板相关疾病的诊断上具有重要的临床价值［１６］如ＧＰⅠｂ／Ⅸ复合物先天缺陷导致巨大血小板综合征；ＧＰⅡｂ／Ⅲａ复合物先天缺陷导致血小板无力症［１７］在免疫性血小板减少性紫癜的患者中，ＦＣＭ可以测定患者血液中的ＰＡＩｇＧ、ＰＡＩｇＭ、ＰＡＩｇＡ，荧光阳性百分率的诊断效率为４５．８％，平均荧光强度的诊断效率为７２．５％，两项指标联合的诊断效率为７４．２％［１８］；因此ＦＣＭ检测血小板抗体可用于免疫性血小板减少性紫癜的诊断及治疗监测用ＦＣＭ内参定位法定量分析血小板微粒在血栓性疾病和血栓前状态的发生发展中的作用，有利于血栓性疾病的诊断和治疗３．７在精子相关疾病检测中的应用精子质量检测是诊断男性不育症的重要手段，由于检测精子数低及主观因素的影响，常规的精液检查只能反映精子的形态特征和有限的功能，不能为生育能力提供准确评估的依据，用ＦＣＭ检查精液可把定性的描述变成定量的研究，提高了实验结果的准确性，可对精液进行高通量、多参数分析，得到不同时期的细胞数据及精子形态指标，对临床诊断精子发生障碍的性质、原因和程度提高了客观依据，可对少、弱精子和无精子症的判断、治疗及疗效的观察作出正确的评价，为客观评价男性生育能力提供了有力的依据。

用ＦＣＭ检测生精细胞凋亡情况是迅速、准确、客观、可靠地评估精子功能和男性生育力的新方法［１９］３．８在器官移植中的作用可用流式细胞术判断供者与受者之间的配型是否合适检测受者血清中抗供者的抗ＨＬＡ抗体，如果受者血清中存在针对供者的循环抗体，就会同供者的淋巴细胞结合，在加入荧光素的二抗来显示这种结合，就可在移植前后发现高风险抗体，以判断供者与受者之间是否合适移植后的免疫表型监测也很重要，移植后的ＣＤ４／ＣＤ８比值低下的患者排斥反应发生较多，受者血清中产生抗供体细胞抗体预后较差，应及时监测以便进行抗排斥的预防和治疗［４］综上所述，流式细胞术是一种在医学基础、临床及科学研究中具有广泛应用前景的细胞分析技术它具有分辨率高、分辨细胞数量大、参数多、准确性高、速度快等优点随着流式细胞分析技术与方法的迅速发展，流式细胞术在临床的应用范围也不断拓展，并将成为推动临床医学发展的重要手段参考文献［１］吴晓娜，蒋红兵．流式细胞术的工作原理及其临床应用〔Ｊ〕．临床工程，２０１１，２６（３）：９１．［２］李超，韩金路，王玉刚，等．流式细胞仪的工作原理及应用〔Ｊ〕．中国实用医药２００９，４（２０）：２３５－２３６．［３］王书奎，周振英．实用流式细胞术彩色图谱〔Ｍ〕．上海：第二军医大学出版社，２００４：１－５８．［４］李华，常莹．流式细胞仪的工作原理及临床应用〔Ｊ〕．中国医疗器械信息２０１１，１７（５）：３７－３８．［５］张瑞华，王进，兰文军．流式细胞术及其在生物医学领域中的应用〔Ｊ〕．山东轻工业学院学报，２０１１，２５（３）：２１－２２．［６］ＩｃｈｉｎｏｈａｓａｍａＲ，ＤｅｃｏｔｅａｕＪＦ，ｍｙｅｒｓＪ，ｅｔａｌ．Ｔｈｒｅｅｃｏｌｏｒｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｉｎｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｍａｌｉｇｎａｎｔｌｙｍｐｈｏｍａｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｃｏｍｐａ。