基因工程实验报告.docx

基因工程实验报告小麦GAPDH截短体的重组与表达摘 要：本实验通过基因工程(genetic engineering)手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩 增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱 导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测通过本对实验的实践，我们对基因工程 技术将会有一个比较全面的认识和了解关键字：小麦基因；载体；感受态前言基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术为在分子水平 上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因 能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作它是用人为的方法将所需要的某一供体生物 的遗传物质一一DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作 为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让 外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术 它克服了远缘杂交的不亲和障碍一) 实验过程1.实验部分流程:2. 小麦总RNA提取（Trizol法）2.1材料小麦幼苗2.2试剂配制及器具处理① 0.1%的DEPC H2O （DEPC：焦碳酸二乙酯）② 器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml的EP管等用纱布包裹，在 0.1%的DEPC H O中浸泡过夜（37°C）,高压灭菌，80°C烘干备用。

剪刀、镊子和药匙等160°C 烘烤6h以上2③ 无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）:用将高温烘烤的玻璃瓶（180CX2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC （体积/体积），处理过夜后高压灭菌④ Trizol⑤ 75%乙醇:用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制）， 然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱⑥ 氯仿（最好用新的）⑦ 异丙醇（最好用新的）2.3操作步骤：① 先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取 50〜100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过 所用Trizol体积的10%），充分混合均匀② 室温放置5min，然后加入200叱的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液 混入，否则重新离心分离），加入500叱异丙醇，温和颠倒混匀室温放置10min，12000rpm 离心10min④ 小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4C下12000rpm离心5min。

⑤ 重复步骤④⑥ 弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5〜10min（注意不要干燥过分，否 则会降低RNA的溶解度）用30此DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55C〜60C水浴 10minRNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70C3. RT-PCR扩增目的基因cDNA3.1 试剂① RNA模板② Olig （dT）18③ 反转录缓冲液④ dNTP⑤ M-MULV反转录酶⑥ RNA抑制剂（RNasin）⑦ Premix EX Taq DNA 聚合酶⑧ PCR特异引物3.2操作步骤：3.2.1 RNA的反转录采用 Thermo Scientific （Fermentas） RevertAid First Strand cDNA Synthesis KitTotal RNA6叱（需加入RNA约1〃g）OligodT primer1叱H O (nuclease-free)265C 5min，补加下列试剂：5叱12叱5 X Reaction buffer4叱RibolockRNase Inhibitor1叱10mM dNTP Mix2叱RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase1此20叱42C 60min70C，5min，-20°C保存3.2. 2 PCR扩增目的基因 用表达引物扩增目的基因（25此体系）2XPCR Mix12.5 叱95 °C1mincDNA1叱95 °C10s引物 GA22PDH1-11叱58C20s 35cycles引物 GAPDH1-21叱72 C45s JHQ9.5叱72 C10mintotal25叱16C8PCR产物经胶回收。

4. 核酸琼脂糖电泳分析4.1试剂① TAE缓冲液（50X）：用时需稀释50倍② 点样缓冲液Loading buffer （10X）：含0.25%漠酚蓝和40%甘油③ 漠乙啶染色液（EB）: 10mg/ml漠乙啶，注意EB具致癌作用④ 琼脂糖4.2操作步骤4.2.1琼脂糖凝胶的制备称1g琼脂糖加入100ml TAE缓冲液中加热熔化4.2.2胶板制备将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后， 将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TAE缓冲液），拔掉梳子注意：缓冲液要高出胶面2mm 4.2.3点样每个样品中加入1/10体积Loading buffer （10X ），混匀后小心地加入点样孔中，要 避免相互污染4.2.4电泳接通电源，80V电压电泳40min左右，当漠酚蓝到达凝胶前沿约2 cm处时停止电泳4.2.5观察及照相将凝胶取出，在EB溶液中浸泡10min后，用凝胶成像系统照相5. pGEX 4T-1质粒的提取5.1实验材料含质粒的大肠杆菌5.2 试剂质粒提取试剂盒（天根生物科技）5.3 操作步骤5.3.1培养细菌将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37^培养24 h,然后从平板上挑取 单菌落，接种于5 mL液体培养基中，37^培养12 h。

5.3.2提取步骤① 柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500叱的平衡液BL， 12,000rpm（~13,400Xg）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管 中请使用当天处理过的柱子）② 取1-5 mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心，12,000rpm（~13,400 乂&）离心1 min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个 离心管中）③ 向留有菌体沉淀的离心管中加入250叱溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）， 使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀④ 向离心管中加入250叱溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解⑤ 向离心管中加入350叱溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时 将出现白色絮状沉淀12,000rpm（~13,400Xg）离心10min，此时在离心管底部形成 沉淀⑥ 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀12,000rpm（~13,400Xg）离心30-60 sec，倒掉收集管中的 废液，将⑦ 吸附柱CP3放入收集管中。

⑧ 向吸附柱CP3中加入600叱漂洗液PW （请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm（~13,400Xg）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入 收集管中⑨ 重复操作步骤7⑩ 将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm（~13,400Xg）离心2min，目的是将吸 附柱中残余的漂洗液去除将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100叱 洗 脱缓冲液EB，室温放置2 min，12,000rpm（~13,400Xg）离心2min将质粒溶液收集 到离心管中5.3.3琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA6表达载体和目的片段的酶切6.1试剂① BamH I ③ BamH I buffer② Sall ④质粒提取试剂盒6.2 操作步骤6.2.1在LB液体培养基中接入带pGEX 4T-1质粒的菌种，在37°C下200rpm摇菌过夜参见实验8的方法提取质粒6.2.2质粒DNA和目的片段的酶切管号①②pGEX 4T-132叱PCR产物32HLddH2O10叱10HLBamH I Buffer (10X)5叱5叱BamH I1叱1叱Sal I2叱2叱7载体和外源DNA的连接反应7.1试剂①目标DNA片段（PCR扩增产物） ④T4 DNA连接酶②载体（pGEX 4T-1酶切回收产物） ⑤ddH）③10X ligation 缓冲液7.2操作步骤取一个200叱的EP管依次加入下列试剂:2 Xbuffer：5叱pGEX 4T-1酶切回收产物：1叱Pfu扩增并酶切回收的片段：3叱T4连接酶：1叱离心30Sec,使反应体系充分混合，16〜22°C连接3〜4h。

8感受态细胞的制备及转化8.1实验材料大肠杆菌 Top 10 或 BL21 （DE3） PlysS8.2试剂① LB培养基（液体和固体培养基配置方法参见附录2）② 氨苄青霉素8.3操作步骤8.3.1感受态的制备① 从LB平板上挑取单克隆于5ml LB培养基中，37°C 200rpm摇菌12〜16h② 将活化过的菌按1〜5%的体积比接种到新的LB液体培养基中，37C 200rpm摇 菌约2h, OD 600约为0.4③ 取1.5ml摇好的菌液于一个1.5ml的EP管中，4C 4000rpm离心3min,弃上清④ 加250叱0.1M的CaCl2 （灭菌预冷）温和悬浮菌体，4C 6000rpm离心1min弃 上清⑤ 加200叱0.1M的CaCl （灭菌预冷）温和悬浮菌体，即为感受态细胞置于4C 存 放12h内使用效果最佳注意：无菌操作和保持低温培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键如果 要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞8.3.2转化① 将盛有感受态细胞的EP管放置于冰上10min，加入10此连接产物（若加质 粒，则只需加1叱），温和混匀，冰浴20~30min② 42C热激90S。

冰浴5~10min③ 加入800HLLB液体培养基，37C培养45〜60min4000rpm离心2min，弃去 800叱上清液，剩余混匀用来涂板④ 取含有50〜100g/mlAmp的LB平板培养基（若进行蓝白斑筛选，在培养皿上 先涂布 4HL 200mg/ml 的 IPTG 和 40叱 20mm/ml 的 X-Gal），涂板⑤ 37 C倒置培养16~20h9克隆的筛选和快速鉴定9.1 试剂① Taq DNA聚合酶 ③ dNTP② 10Xbuffer （含 MgCl ） ④ Loading buffer9.2 操作步骤 29.2.1提取质粒测定取一培养皿在底部标记，待转化的细菌菌落长直径到2mm时，用接种针（或用灭菌的 牙签、小枪头）挑取单克。