引物的5端修饰法.doc

引物的引物的 5 端修饰法端修饰法PCR 的延伸是从二引物 3 端开始的，并决定着 PCR 产物的特异性，而 5 端则限定 PCR 产物的长度5 端修饰后不但不影响正常的 PCR反应，实际上是给 PCR 产物的 5 端人为的加上一段有意义的序列，对于 PCR 产物的分析与进一步操作有很大的方便（一）5 端附加核酸序列：根据不同的实验目的，可以在引物 5 端附加长达 45 个核苷酸的序列而不影响 PCR加序列的方法很简单，在合成引物时，在 5 端合成上所设计的序列就可在加酶切位点时，需注意在酶切位点的 5 端应再加上 2~4 个无关碱基，以确保产物的酶切效果简并引物简并引物指碱基序列不同，但有相同碱基数的一组针对某一基因相同区域的寡核苷酸混合物它能成功用于 PCR有时非常有效：第一：当待序列不明，且仅知其一部分蛋白质序列时，根据蛋白质序列可合成一组简并引物来克隆这一基因利用这种方法已成功克隆了尿酸盐氧化物酶第二：据已知序列寻找一个基因家族寻找新的，或未确定的成员时，如根据反转录酶氨基酸序列保守区设计的简并引物可同时检测哺乳类和鸟类的疱疹病毒第三：当扩增一个基因家族中不同成员序列以便分型鉴定时，也可用简并引物的设计：设计时应考虑的因素：1 氨基酸密码子的简并性：由于氨基酸密码子的简并程度不同，对选定扩增区氨基酸的要求是简并程度要尽量低， 。

甲硫氨酸和色氨酸只有一个密码子所以优先选择它俩尽管高达 516 倍简并引物可成功应用，但是，简并程度越低，特异性越高因此，选择扩增引物区内尽量不要含有 4~6 个简并密码子编译的氨基酸2 密码子的偏性不同生物，不同密码子偏性，所以针对某一种生物时，选择它偏好的3 引物的简并程度：原则上简并程度越低越好虽高达 1024 倍的简并引物已成功用于 PCR，但是最好不要超过 516 倍，一种降低简并程度的好方法是在高度简并位点用次黄嘌呤（dI）替代因为它可与任何碱基配对含有 4~7 个次黄嘌呤的引物已成功的用于克隆大肠杆菌醛缩酶基因，含 dI 引物的特异性决定于 cDNA 的浓度。