染色质免疫共沉淀PPT.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2012/10/13,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2012/10/13,#,染色质免疫共沉淀,(ChIP),目录,简介,技术原理,技术流程,应用,优缺点,一、简介,DNA,与蛋白质相互作用研究,DNase,足纹法,电泳迁移率变动分析,生物信息学方法,酵母单杂交系统,ChIP,一、简介,ChIP,是目前唯一研究体内,DNA,与蛋白质相互作用的方法不仅可以检测体内反式因子与,DNA,的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达关系二、原理,在活细胞状态下固定蛋白质,DNA,复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合物，特异性地富集目的蛋白结合的,DNA,片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与,DNA,相互作用的信息三、技术流程,具体操作流程,DNA,分析,1,、甲醛交联细胞,具,体,步,骤,10,ml1PBS,孵育,8min,弃上清,4-5ml,预,冷,1 PBS,预冷,1PBS,洗涤两次,转移,4000rpm,离心,5min,弃上清,1ml,预冷,1PBS,悬浮,新离心管,4000rpm,离心,5min,1ml1,.,25mol/L,甘氨酸,室温,10-20min,2,、染色质超声断裂,1.,加,SDS,裂解溶液重悬浮沉淀，冰上,10min,.,每,1min,颠倒摇动一次离心管。

2.,把,DNA,粉碎为长度,200-1000bp,，置于冰上不同样本都进行超声条件优化实验3.,14000rpm,离心,10min,（,4,）,，转移,上清于,1.5ml,离心管3.,免疫沉淀蛋白和,DNA,复合物,超声染色质液体,2ml,超声稀释液,4,摇床摇动一小时,1000rmp,离心,2min,（,4,）,转移上清液至新离心管,ChIP,稀释液稀释,10,倍,加入,20l,蛋白,A/G,琼脂糖珠,1-4l,免疫沉淀抗体,取,50l,上清液作为对照,？,？,4,、收获免疫复合物（抗体,-,蛋白质,-DNA,）,样品,摇动,1-2h,，,4,40lProtein A/G Agarose Beads,1PBS,洗,3,次离心,1000rpm,1min.,弃上清，用,4l 1PBS,悬浮,1000rpm,离心,5min,4,a,低盐洗脱溶液,1ml,洗一次,b,高盐洗脱溶液,1ml,洗一次,c,氯化锂洗脱溶液,1ml,洗一次,d TE,溶液,(pH8.0)1ml,洗两次,每次洗时，在摇床上摇,10min,4,，,4000rpm,离心,5min,弃上清,5,、洗脱免疫复合物,Beads,200lChIP,洗脱溶液洗脱,摇床上摇动,10min,12000rpm,离心,1min,取上清,Beads,取上清,200l,ChIP,洗脱溶液,(3,次,),600l,洗脱液,6,、去除甲醛交联,加,5mlNaCl,使用,NaCl,终浓度为,0.2mol/l,阴性对照,+350lChIP,洗脱溶液,+16l,5mol/l NaCl,。

65,过夜,去交联7,、,DNA,纯化,酚,/,氯仿抽提,实验样本,(600l),50l,阴性对照,10lRNase,50l,蛋白酶,K,等量酚,/,氯仿,/,异戊醇（,25:24:1,）,12000rmp,离心,5min,上清液,上清液,1/10,体积,3mol/l,乙酸钠,2,倍体积冰冻无水乙醇,-80,冰箱,1h.12000rmp,离心,20min,，弃上清,加入,70%,乙醇，悬浮沉淀，,12000rpm,离心,10min,，去上清，,DNA,干燥后，,40lTE,溶解,硅胶柱纯化,8,、染色质免疫共沉淀,DNA,的分析和蛋白质在,DNA,上结合位点的鉴定,(1),如果目的蛋白靶序列已知，或怀疑某一序列是目的蛋白靶序列，则可选用定量或者半定量,PCR,方法2),如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因组分布情况，找出转录因子结合位点，则可采用,ChIP,克隆测序，,ChIP-chip,，和,ChIP-seq,方法四、应用,组蛋白修饰研究,转录调控分析,药物开发研究,有丝分裂研究,DNA,损伤与凋亡分析,五、优缺点,优点：充分反映生理条件下,DNA,与蛋白质相互作用的真实情况，可以找出生理条件下某个,DNA,结合蛋白与,DNA,序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况。

缺点：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难以获得；为了获得高等丰度的结合片段，必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的基因获取可能需要限制在组织来源谢谢大家！,。