评价软胶囊中明胶交联反应的相关指标间的相关性及影响因素.doc

评价软胶囊中明胶交联反应的相关指标间的相关性及影响因素摘要：目的评价明胶交联反应指标间的相关性，考察影响软胶囊中明胶交联反应的因素，探讨软胶囊溶出迟缓机理方法采用甲醛处理软胶囊囊壳模拟交联反应，进行明胶溶胀动力学和溶出度实验，采用 I'NBS法测定 一氨基酸含量应用差示热扫描分析明胶结构的变化结果 明胶交联后，平衡膨胀量(S )、百分溶出量和氨基酸含量之间呈良好线性关系；平衡膨胀量、氨基酸含量与软胶囊崩解时问呈良好线性关系；在40℃或光照[(4 500±500)ix]条件下放置的软胶囊囊壳的S 显著低于室温避光下放置的软胶囊(P<0．01)；甘氨酸和焦亚硫酸钠能有效阻止S 的降低；明胶发生交联后，分子中螺旋一卷曲转变消失结论明胶平衡膨胀量(S )、百分溶出量和氨基酸含量从不同角度反映交联反应程度，有良好相关关系(r=0．995 3—0．998 5)；高温、光线会促发明胶交联反应；抗氧剂能延缓交联反应的发生；明胶分子中螺旋一卷曲转变消失，水化作用减弱，是软胶囊溶出迟缓的主要原因软胶囊在储存期出现崩解或溶出迟缓现象，是软胶囊研制和生产中遇到的常见问题，已引起国内外制药界的关注。

研究认为⋯ ，软胶囊溶出迟缓主要是由囊壳材料——明胶产生交联反应所致明胶的氧化及低分子醛类物质是导致交联反应的主要因素明胶是由胶原蛋白水解而来的多肽片段，其分子中的氨基酸(主要是赖氨酸和精氨酸)所含有的侧链基团，在发生氧化或自氧化反应时形成醛基，促发交联反应，引起明胶结构中的胶原胶束发生变性，使软胶囊难以溶解，溶出时间明显延长因此明胶的溶出度、平衡膨胀量和内容物含醛量可作为明胶交联反应的指标，而定量测定明胶中氨基酸的含量可以从分子水平反映明胶交联反应程度本项目前期通过模拟明胶胶片，研究了环境因素和处方因素对明胶交联反应的影响 考虑到软胶囊中药物成分的影响，尤其是许多中药提取物中含有醛基基团，很容易引发明胶的交联反应，本研究以中药银杏黄酮为模型药物制备软胶囊，考察温度、湿度、光线以及附加剂对囊壳交联反应的影响；采用甲醛处理胶囊壳模拟明胶交联，考察明胶平衡膨胀量、百分溶出量和氨基酸残基含量3种指标之间的相关性；研究软胶囊在加速实验条件下，明胶平衡膨胀量和氨基酸残基含量与崩解时间的相关性；采用差示热扫描法分析明胶结构的变化，探讨软胶囊溶出迟缓形成机理，以正确评价软胶囊质量，指导软胶囊剂的处方工艺设计和贮存条件选择。

材料与方法仪器与试药 752型UV光栅分光光度计(上海分析仪器总厂)；ZRS-SG型智能溶出实验仪(天津大学无线电厂)；DSC20OPC型差示扫描量热仪(德国NETZSCH公司)明胶(青海明胶股份有限公司)；聚乙二醇400(PEG400)(中国医药集团上海化学试剂公司)；Folin．酚试液(北京欣经科生物技术公司)；三硝基苯磺酸(TNBS)溶液(5％ ，Sigma公司)；甲醛原液(37．32％ ，中国上海化学试剂研究所)，银杏黄酮软胶囊(中国药科大学药物制剂研究所提供，主要成分为：银杏黄酮、明胶、甘油等)明胶平衡膨胀量测定 明胶有限溶胀过程符合以下二级动力学方程式：式中：ds／dt为某一时间的溶胀速率； 为溶胀速率常数；S 为平衡膨胀量；S为膨胀率，其计算方法为其中Ws 为该胶片t时间时的重量；WI 为胶皮初始干重量公式(1)积分并经数学简化后得：其中由公式(2)可知，Seq 的值可由t／s—t直线的斜率B确定将银杏黄酮软胶囊沿中缝切开，挤出内容物，用无水乙醇洗涤3次，室温下干燥至囊壳含水量10％左右取6粒囊壳分别标号，精密称重，置于蒸馏水500 mL中进行溶胀，于l，2，2．5，3，3．5和4 h取出囊壳擦干，精密称重。

另取6粒于105℃烘干至恒重，求出胶囊壳初始干重，计算不同时间点囊壳的S值按公式(2)回归计算Seq明胶溶出实验 明胶含量测定采用Folin．酚法 ，标准曲线方程为：A=0．001 5C+0．007 9(r=0．999 2)，其中，C为明胶蛋白质的浓度按上述方法将去除内容物、洗涤并干燥的银杏黄酮软胶囊壳进行溶出实验溶出条件：37 ，100r·min-1，以蒸馏水为介质，30 min取样(为空白胶囊壳完全溶解的时间)明胶氨基酸含量测定 按上述方法将去除内容物，洗涤并干燥的软胶囊壳粉碎，称取粉末l1mg浸入4％ NaHCO3 l mL与0．5％三硝基苯磺酸(TNBS)l mL的混合溶液中，40 保温4 h，然后加入6 mol·L-1 HC1 3 mL，于120℃ ，1．1 kPa下加热l h，所得溶液用水5 mL稀释，乙醚萃取3次吸取水相5 mL，热水浴加热15 min，冷至室温，加水l5mL稀释后以空白溶液为对照于346 nm下测定吸收值A空白溶液制备时需在加入TNBS溶液前加入HCl，其余步骤同前所得吸收值按下式处理：з- 氨基酸残基含量(Y)=mA其中，A为吸收度，m为公式简化常数，在光通路为l cm，样品重量为ll mg时其值为1．830 2×10-4。

甲醛对明胶平衡膨胀量、溶出速率及氨基酸含量的影响 配制质量浓度分别为0，2．75，3．68，4．59，5．5l，7．35和8．26 mg·mL 甲醛溶液200mL，取空白软胶囊壳6×5粒分别于不同浓度甲醛溶液中浸泡15 min，取出擦干按上述方法分别进行溶出、溶胀等实验，测定明胶平衡膨胀量、溶出百分率和氨基酸残基量，考察三者之间的相关性温度、湿度和光线对交联反应的影响 按市售包装将银杏黄酮软胶囊在不同温度、湿度和光线条件下贮存3个月，定时取样，测定胶囊壳的Seq值附加剂对明胶平衡膨胀量和崩解时间的影晌 在原软胶囊囊壳配方中加人不同附加剂制备软胶囊，在40℃，RH 75％条件下放置3个月，定时取样，测定明胶胶壳的Seq值根据上述附加剂对Seq值的影响，在银杏黄酮软胶囊囊壳处方中添加1％焦亚硫酸钠，制成软胶囊在40℃ ，RH 75％条件下放置3个月，定时取样，测定软胶囊的崩解时限明胶平衡膨胀量、氨基酸含量与崩解时间的相关性考察 将银杏黄酮软胶囊在40℃，RH 75％条件下放置3个月，定时取样，分别测定软胶囊的崩解时间、明胶胶壳的Seq值和氨基酸残基量，考察相关性差示热分析分别对空白胶囊壳、甲醛处理后的胶囊壳和40℃ ，RH 75％条件下放置3个月的胶囊壳进行DSC测定，升温速度1℃ ·min-1，升温范围10-200℃ 。

结果1 甲醛对明胶平衡膨胀量、溶出速率及氨基酸含量的影响 甲醛处理囊壳的平衡膨胀量、氨基酸含量及百分溶出量测定结果见表1Table 1 Swelling equilibrium quantity，dissolutionrate and amino group content of formaldehydecrossHnkedcapsule shells(n=8)从表1可见，随着甲醛浓度的增加，胶囊壳中明胶的平衡膨胀量、氨基酸含量与百分溶出量均下降以平衡膨胀量对甲醛浓度进行回归，得方程：S =一1．66C+l9．97，r=0．998 6；以溶出百分率(D)对甲醛浓度(C)进行回归，得方程：D =一l2．43c+1 15．0l，r=0．991 2；以氨基酸含量(A)对甲醛浓度进行回归，得方程：A=一3．42×10 C+3．42×10一，r=0．993 2；对平衡膨胀量(S )、溶出百分率和氨基酸残基含量测定结果进行相关性分析，结果为：D =7．45Seq - 34．09， r=0．995 3D =3．63×105A一4．94． r=0．998 5Seq = 4．86×104A -3．93， r=0．998 5上述结果表明，明胶在甲醛作用下发生交联后，其平衡膨胀量、溶出百分率和氨基酸残基含量之间均有良好线性关系。

2 温度、湿度和光线的影响银杏黄酮软胶囊在不同温度、湿度和光线条件下贮存3个月，其胶囊壳的S 值见表2由表2看出，在25℃(25％ RH与75％ RH)贮存的胶囊壳45 d后的S 与零时间相比有极显著性差异(P<0．01)，而40℃=(25％ RH与75％ RH)或25℃见光贮存时，从15 d开始，胶囊壳的S 与零时间相比就有极显著性差异(P<0．01)样品放置90 d后，40℃ ，25％ RH和75％ RH条件下胶囊壳的S 值分别为零时间的46．60％和43．19％ ；光照条件(40℃ ，25％ RH)下胶囊壳的S为零时间的59．65％ ，均显著低于25℃(25％ RH或75％ RH)条件下胶囊壳的S 值(为零时间的65．67％ )在相同温度(25℃或40℃)条件下，不同湿度(25％ RH与75％ RH)对胶囊壳的S 值影响不大3 附加剂的影响在空白囊壳(含明胶、甘油和水)中加人不同赋形剂制成软胶囊，在40℃，RH 75％条件下放置3个月，测定胶囊壳中明胶的S 值，结果见表3表3所列附加剂为软胶囊中常用的抗氧剂、增塑剂、表面活性剂、着色剂和避光剂及常用浓度结果显示，加入这些附加剂的软胶囊在4O℃，75％ RH放置3个月后，囊壳中明胶的Seq值有不同程度的变化，其大小依次为甘氨酸、焦亚硫酸钠、丙二醇、吐温-8O、二氧化钛、氧化铁、山梨醇。

其中，丙二醇、吐温-8O(低浓度)与空白囊壳的5 值相比有显著性差异(P<0．05)，山梨醇、吐温-8O(高浓度)、氧化铁和二氧化钛与空白囊壳的Seq值相比有极显著性差异(P<0．01)随着浓度升高，丙二醇、吐温-8O、氧化铁的Seq值有下降趋势，而二氧化钛、甘氨酸、焦亚硫酸钠的Seq值有上升趋势甘氨酸和焦亚硫酸钠的的Seq值与空白囊壳相比变化很小囊壳处方中加入1％焦亚硫酸钠的银杏黄酮软胶囊，在4O ℃，RH 75％条件下放置6个月，其崩解时限结果如图1所示图l表明，未加附加剂的软胶囊在加速实验条件下，其崩解度随时间变化较大，6个月已超过2Orain(JPX II规定的标准崩解时限 )加入l％ 焦亚硫酸钠的软胶囊，在同样条件下，崩解度随时间变化较小，二者数据相比有显著性差异(P<0．05)4 明胶平衡膨胀量、氨基酸含量及软胶囊崩解时间的相关性 银杏黄酮软胶囊在4O ℃，RH 75％条件下放置3个月，其软胶囊的崩解时间、明胶胶壳的Seq值和氨基酸含量结果见表4以平衡膨胀量对崩解时间进行回归，得方程：Seq =-0．490 4B+12．87，r=0．986 3；以氨基酸含量对崩解时间进行回归，得方程：A=-0．380 9B+24．11，r=0．994 9。

可见明胶的平衡膨胀量和氨基酸含量与软胶囊崩解时间均呈良好线性关系5 差示扫描热分析 空白胶囊壳、甲醛处理胶囊壳和加速放样(40 ℃，RH 75％)3个月软胶囊囊壳的DSC测定结果如图2所示讨论1 交联反应指标的相关性软胶囊崩解迟缓现象与囊壳主要成分—— 明胶的溶解性质发生改变有关明胶是由多肽单链通过氢键相连形成的具有三维螺旋状空间结构的大分子：当明胶与水接触时发生溶胀，水分子插入链间，氢键的作用减弱，明胶分子向高弹态转变溶胀后的明胶加热溶解时，三维螺旋状体系能量增高，明胶分子变成卷曲结构，由高弹态向溶液态转变，形成具有一定粘性的溶液因此明胶能否发生溶解与能否实现螺旋．卷曲转变密切相关 ：明胶蛋白分子中包含众多的氨基酸残基，其中，一氨基酸残基是明胶分子发生交联反应的主要位点之一? 一氨基酸残基是存在于赖氨酸上的一类胺类残基，其结构为R—NH ，根据其结构和性质，其反应方程 为：R·NH2+HCHO +R·NH21 R·NH—CH2-NH·R +H2O 可见1。